כימותרפיה-אנזימטי סינתזה של N- glycans עבור מערך פיתוח נוגדן HIV פרופיל
Summary
בגישה מודולרית הסינתזה של N– glycans עבור הקובץ המצורף הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד שקופיות (שקופית ACG) וגם microarray glycan פותחה לשימוש פרופיל של HIV בהרחבה נטרול נוגדנים הוכח.
Abstract
אנו מציגים דרך יעילה במיוחד עבור הכנה מהירה של מגוון רחב של N-מקושרים oligosaccharides (מוערך יעלה על 20,000 מבנים) אשר נמצאים בדרך כלל על אדם glycoproteins. כדי להשיג את הגיוון מבניים הרצוי, האסטרטגיה החל הסינתזה כימותרפיה-אנזימטי של שלושה סוגים של מודולים פלואוריד oligosaccharyl, ואחריו שלהם stepwise glycosylations α-סלקטיבית של 3-O ו 6-O עמדות של מנוז שאריות trisaccharide ליבה משותפת שיש חיבור אמיתי מכריע β-mannoside. בהמשך קשרנו את N– glycans השטח של שקופיות זכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד (ACG) כדי ליצור מערך מעורב קוולנטיות לניתוח של הטרו-ליגנד אינטראקציה עם נוגדן HIV. בפרט, הקלד התנהגות מחייב שזה עתה מבודד HIV-1 נטרול בהרחבה נוגדנים (bNAb), PG9, לתערובת של האיש צפופים5GlcNAc2 (אדם5) ומורכב 2, 6-di-sialylated דו-antennary N– glycan (SCT ) על מערך ACG, פותח שדרה חדש כדי להנחות את העיצוב immunogen יעיל עבור פיתוח החיסון HIV. בנוסף, מערך ACG שלנו מגלם כלי רב עוצמה כדי ללמוד אחרים נוגדנים HIV להתנהגות הטרו-ליגנד מחייב.
Introduction
N– glycans על glycoproteins covalently מקושרים של אספרגין (Asn) שאריות של sequon Asn-Xxx-Ser/חמישי הקונצנזוס, אשר משפיעים על מספר תהליכים ביולוגיים כגון זיהוי חלבונים קונפורמציה, antigenicity, המסיסות, לקטין 1 , 2. סינתזה כימית של N-oligosaccharides מקושר מייצג סינתטי אתגר משמעותי בשל הטרוגניות מיקרו מבני ענק ואדריכלות מסועף מאוד שלהם. בחירה זהירה של הגנה על קבוצות לכוון תגובתיות של אבני הבניין, להשגת סלקטיביות מרכזי anomeric, ועל שימוש נכון יזם / activator(s) הם רכיבי מפתח של סינתזה של oligosaccharides מורכבים. כדי לפתור בעיה זו של מורכבות, כמות גדולה של עבודה כדי לקדם סינתזה – glycan Nדווח לאחרונה3,4. למרות הגישות האלה חזקים, מציאת שיטה יעילה עבור הכנת מגוון רחב של N– glycans שרידים (~ 20,000) תואר אתגר.
קצב מוטציה מהירה של HIV-1 כדי להשיג את מגוון גנטי מקיף ואת יכולתו לברוח מן לנטרל תגובת נוגדנים, הוא בין האתגרים הגדולים ביותר כדי לפתח את החיסון בטוח, אמצעי מניעה נגד HIV-15,6 , 7. אחד טקטיקה יעילה HIV משתמש כדי למנוע את התגובה החיסונית של המארח הוא גליקוזילציה post-translational של המעטפה gp120 גליקופרוטאין עם מגוון N-מקושרים glycans נגזר מארח גליקוזילציה מכונות8, 9. דו ח זה התבצעה לגבי ניתוח מדויק של גליקוזילציה gp120 HIV-1 monomeric רקומביננטי מתאי 293T כליה אנושית עובריים (HEK) מרמז על המופע של microheterogeneity מבניים עם תבנית ספציפית תא אופיינית10 , 11 , 12. לפיכך, הבנה specificities glycan של HIV-1 bNAbs דורש טוב מאופיין gp120 הקשורים N– glycan מבנים בכמות מספקת לצורך ניתוח.
גילוי glycan microarray טכנולוגיה בתנאי חקר מבוססות תפוקה גבוהה של specificities של מגוון רחב של חלבונים פחמימות-כריכה, וירוסים/בקטריאלי adhesins, רעלים, נוגדנים lectines13,14 . הסידור glycans שיטתית בתבנית ערוכים מבוססי שבב יכול לקבוע זיקה נמוכה בעייתי אינטראקציות חלבון-glycan דרך המצגת multivalent15,16,17,18. סידור glycan מבוססי שבב זה מופיע בנוחות לחקות ביעילות תאים תאים ממשקים. כדי להעשיר את הטכנולוגיה להתגבר על הבעיה לא אחידה המשויך מערך קונבנציונאלי תבניות, הקבוצה שלנו פותח לאחרונה מערך glycan שקופית הזכוכית מצופה אלומיניום אוקסיד (ACG) באמצעות glycans הסתיימה חומצה phosphonic כדי לשפר את עוצמת האות, הומוגניות, רגישות19,20.
כדי לשפר את ההבנה הנוכחית על glycan epitopes של לאחרונה מבודד HIV-1 בהרחבה נטרול נוגדנים (bNAbs), פיתחנו אסטרטגיה מודולרי יעילה במיוחד עבור הכנת מערך רחב של N-מקושרים glycans21 ,22 יודפס על ACG שקופית (ראה איור 1). ירידה לפרטים מחקרים פרופיל של HIV-1 bNAbs על מערך ACG הציע זיהוי חריג הטרו-glycan מחייב התנהלות חזק מאוד bNAb PG9 שהיה מבודד HIV נגוע יחידים23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחלקה של HIV-1 bNAbs כולל PG9, PG16 ו PGTs 128, 141-145 דווחו להיות חזק מאוד בהשמדת 70-80% של מחזורי מבודד HIV-1. Epitopes של bNAbs האלה מאוד נשמרים בין המשתנים של כל הקבוצה HIV-1 מ’, ולכן הם להנחות את העיצוב immunogen יעיל עבור חיסון HIV שמעודדים נטרול נוגדנים23,24,25 . כחלק מהמאמצ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים תודה את חטיבת טכנולוגיות סרט דק, מרכז מחקר טכנולוגיית כלי נגינה (ITRC), לאומי מוחל מעבדות מחקר, שער המזרח, טייוואן. עבודה זו נתמכה על ידי המועצה הלאומית למדע (מענק. לא. רוב 105-0210-01-13-01), אקדמיה Sinica.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
References
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
- Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
- Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
- Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
- Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
- Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
- Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
- Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
- Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
- Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
- Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
- Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
- Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
- Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
- Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
- Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
- Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
- Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
- McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
- Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
- Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
- de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).
