JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
화학

Chemo-enzymatisk syntese av N- glykaner for matrisen utvikling og HIV antistoff profilering

Published: February 05, 2018
doi:
10.3791/55855
, , ,
1Genomics Research Center,Academia Sinica

Summary

En modulær tilnærming til syntesen av N– glykaner for å feste til en aluminiumoksid-belagt glass skyve (ACG lysbilde) som en glycan microarray er utviklet og bruk for profilering av en HIV bredt nøytralisere antistoffer har vist.

Abstract

Vi presenterer en svært effektiv måte for rask utarbeidelse av et bredt spekter av N-koblet oligosaccharides (estimert overstiger 20.000 strukturer) som ofte finnes på menneskelig glykoproteiner. For å oppnå ønsket strukturelle mangfoldet, strategien begynte med kjemoterapi-enzymatisk syntesen av tre typer oligosaccharyl fluor moduler, etterfulgt av deres gradvis α-selektiv glycosylations på den 3-O og 6-O stillinger på den mannose rester av den felles kjerne trisaccharide har en avgjørende β-mannoside kobling. Vi ytterligere knyttet N– glykaner på overflaten av en aluminiumoksid-belagt (ACG) objektglass opprette en kovalente blandet matrise for analyse av hetero-ligand interaksjon med et HIV antistoff. Spesielt type bindingsmåte av en nylig isolert HIV-1 bredt nøytraliserende antistoff (bNAb), PG9, blandingen av tett linjeavstand mann5GlcNAc2 (mann5) og 2,6-di-sialylated bi-antennary kompleks N– glycan (SCT ) på en ACG matrise, åpner en ny vei å veilede effektiv immunogen design for HIV vaksineutvikling. I tillegg bærer våre ACG matrise et kraftig verktøy for å studere andre HIV antistoffer hetero-ligand binding oppførsel.

Introduction

N– glykaner på glykoproteiner kobles covalently til asparagine (Asn) rester av konsensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, som påvirker flere biologiske prosesser som protein konformasjon, antigenicity, løselighet og Lektiner anerkjennelse 1 , 2. kjemisk syntesen av N-koblede oligosaccharides representerer en betydelig syntetiske utfordring på grunn av deres store strukturelle mikro heterogenitet og svært forgrenet arkitektur. Nøye utvalgte beskytte grupper for å tune reaktivitet av byggeklosser, oppnå selektivitet anomeric sentre, og riktig bruk av arrangøren / activator(s) er viktige elementer i syntesen av komplekse oligosaccharides. For å løse dette problemet med kompleksiteten, en god mengde arbeid å fremme N– glycan syntese ble rapportert nylig3,4. Til tross for disse robust tilnærminger, finne en effektiv metode for utarbeidelse av en rekke N– glykaner (~ 20 000) fortsatt en stor utfordring.

Rask Mutasjonshastigheten av HIV-1 omfattende genetisk mangfold og dens evne til å flykte fra nøytralisere antistoffet svaret, er blant de største utfordringene å utvikle en sikker og forebyggende vaksine mot HIV-15,6 , 7. en effektiv taktikk som HIV bruker å unngå immunrespons vert er den post-translasjonell glykosylering av konvolutten glykoprotein gp120 med en variert N-koblet glykaner avledet fra verten glykosylering maskiner8, 9. En fersk rapport om nøyaktig analyse av rekombinant monomerisk HIV-1 gp120 glykosylering fra menneskelige embryonale (HEK) 293T nyreceller antyder forekomsten av strukturelle microheterogeneity med en karakteristisk celle-spesifikke mønster10 , 11 , 12. derfor forståelse glycan særegenheter av HIV-1 bNAbs krever også preget gp120 knyttet N– glycan strukturer i et antall tilstrekkelig for analyse.

Oppdagelsen av glycan microarray teknologi gitt høy gjennomstrømming-baserte utforskning av spesifisiteter av en rekke ulike karbohydrat-bindende proteiner, virus/bakteriell adhesins, toksiner, antistoffer og lectines13,14 . Systematisk glykaner ordningen i et plassert chip-basert format kan fastslå problematisk lav affinitet protein-glycan vekselsvirkningene gjennom multivalent presentasjon15,16,17,18. Chip-baserte glycan ordningen beleilig vises å etterligne effektivt celle-celle grensesnitt. Å berike teknologien og overvinne ujevn spørsmålet forbundet med konvensjonelle matrise formater, utviklet vår gruppe nylig et glycan utvalg på aluminiumoksid-belagt glass (ACG) lysbilder med phosphonic syre-slutt glykaner for å forbedre signal intensiteten, homogenitet og følsomhet19,20.

For å forbedre gjeldende forståelse glycan epitopes nylig isolert HIV-1 bredt nøytralisere antistoffer (bNAbs), har vi utviklet en svært effektive modulbaserte strategi for utarbeidelse av en rekke N-koblet glykaner21 ,22 skal skrives ut på en ACG Skyv (se figur 1). Spesifisitet profilering studier av HIV-1 bNAbs på tabelldata ACG tilbys uvanlig påvisning av hetero-glycan binding virkemåten til svært potent bNAb PG9 som ble isolert fra HIV infisert enkeltpersoner23,24,25.

Protocol

1. utarbeidelse av D1/D2 Arm moduler22 Utarbeidelse av mellomtid 2 Veie starter materiale 1 (vist i figur 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) i en 15 mL tube og løses i Tris buffer (25 mM, pH 7.5) som inneholder mangan dichloride (MnCl2, 10 mM) for å oppnå en siste glycan konsentrasjon av 5 mM. Legg 2 ekviv…

Representative Results

En modulær chemo-enzymatisk strategi for syntesen av en rekke N -glykaner vises i figur 1. Strategien er basert på det faktum at mangfold kan opprettes i begynnelsen av kjemoterapi-enzymatisk syntese av tre viktige modulene, etterfulgt av α-spesifikke mannosylation på den 3-O og/eller 6-O posisjon mannose restene av felles Core trisaccharide av N- glykaner. Vurderer strukturelle mangfoldet av bi-, tre- og tetra-antennar…

Discussion

En klasse av HIV-1 bNAbs inkludert PG9, PG16 og PGTs 128, 141-145 ble rapportert å være svært potent i å nøytralisere 70-80% av sirkulerende HIV-1 isolater. Epitopes av disse bNAbs er svært bevart blant variantene av alle HIV-1 M, derfor de kan guide effektiv immunogen design for en HIV vaksine å lokke fram nøytraliserende antistoffer23,24,25 . Som en del av å identifisere glycan epitopes av HIV-1 bredt nøytralisere an…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne takke tynn Film Technology Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) og National anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council (gi nei. De fleste 105-0210-01-13-01) og Academia Sinica.

Materials

Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).

Tags

Chemo-enzymatic SynthesisN-glycansGlycan MicroarrayHIV Antibody ProfilingGlycobiologyCell Virus Specific GlycansGlycoarrayInfluenza DiagnosisCancer DiagnosisSerum AntibodiesGlycan SpecificitiesPhosphonic Acid LinkerPolyacrylamide GelTLCCerium Ammonium MolybdatePalladium HydroxideHydrogen Atmosphere
check_url/kr/55855?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C., Wong, C. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image