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화학

Quimio-enzimático síntese de N- os glicanos para desenvolvimento de matriz e anticorpos de HIV de criação de perfil

Published: February 05, 2018
doi:
10.3791/55855
, , ,
1Genomics Research Center,Academia Sinica

Summary

Uma abordagem modular para a síntese de N– os glicanos para fixação a um vidro revestido de óxido de alumínio slide (slide ACG) como desenvolveu um microarray glicano e demonstrou-se seu uso para a criação de perfil de um HIV amplamente neutralizando anticorpos.

Abstract

Apresentamos uma maneira altamente eficiente para a preparação rápida de uma vasta gama de N-ligadas a oligossacarídeos (estima-se que para exceder 20.000 estruturas) que são comumente encontrados em glicoproteínas humanas. Para alcançar a desejada diversidade estrutural, a estratégia começou com a síntese enzimática de quimioterapia de três tipos de módulos de fluoreto de oligosaccharyl, seguidos por sua gradual glycosylations α-seletiva para o 3-Ó e 6-O posiciona do resíduo de manose do trissacarídeo núcleo comum, tendo uma ligação crucial β-mannoside. Ainda mais, nós unimos os N– glicanos à superfície de uma lâmina de vidro revestido de óxido de alumínio (ACG) para criar uma matriz covalente mista para a análise da interação de hetero-ligante com um anticorpo de HIV. Em particular, o comportamento de vinculação de um recém isolados VIH-1 amplamente neutralizante anticorpo (bNAb), PG9, a mistura de espaçadas homem5GlcNAc2 (homem5) e 2,6-di-sialylated bi-antennary complexo tipo N– glicano (SCT ) em uma matriz ACG, abre uma nova avenida para guiar o projeto immunogen eficaz para o desenvolvimento de vacina contra HIV. Além disso, nossa matriz ACG encarna uma poderosa ferramenta para estudar outros anticorpos de HIV para o comportamento de vinculação de hetero-ligante.

Introduction

Os N– glicanos em glicoproteínas estão covalentemente ligados à asparagina (Asn) resíduo de sequon de Asn-Xxx-Ser/Thr o consenso, que afetam vários processos biológicos, tais como reconhecimento de conformação, antigenicidade, solubilidade e lectina de proteína 1 , 2. a síntese química de N-oligossacarídeos vinculados representa um desafio sintético significativo devido à sua enorme heterogeneidade micro estrutural e arquitetura altamente ramificada. A seleção cuidadosa de proteger grupos de sintonizar a reatividade dos blocos de construção, alcançar a seletividade em centros anomérico e uso correto de promotor / activator(s) são elementos-chave na síntese de oligossacarídeos complexos. Para resolver este problema da complexidade, uma grande quantidade de trabalho para avançar N– glicano síntese foi relatada recentemente3,4. Apesar dessas abordagens robustas, encontrar um método eficaz para a preparação de uma vasta gama de N– os glicanos (~ 20.000) permanece um grande desafio.

A taxa de mutação rápida do HIV-1 para atingir a extensa diversidade genética e sua capacidade de escapar de neutralizar a resposta imunitária, está entre os maiores desafios para desenvolver uma vacina segura e profilática contra HIV-15,6 , 7. uma tática eficaz que o HIV usa para evitar a resposta imune do hospedeiro é a glicosilação pós-traducional de gp120 de glicoproteína do envelope com um diverso N-ligados os glicanos derivados do anfitrião glycosylation máquinas8, 9. Um relatório recente sobre a análise precisa de recombinação monomérico HIV-1 gp120 glicosilação de células de rim humano embrionário (HEK) 293T sugere a ocorrência de microheterogeneity estrutural com um padrão característico de célula específico10 , 11 , 12. portanto, a compreensão das especificidades de glicano do HIV-1 bNAbs requer gp120 bem caracterizadas relacionados N– glicano estruturas em quantidade suficiente para análise.

A descoberta da tecnologia microarray de glicano fornecido alta exploração baseada na taxa de transferência de especificidades de uma diversa gama de proteínas carboidratos, adesinas vírus/bactérias, toxinas, anticorpos e lectines13,14 . O arranjo os glicanos sistemática em um formato de matriz baseada no chip poderia determinar interações do proteína-glicano problemático baixa afinidade a apresentação multivalentes15,16,17,18. Este arranjo de chip baseada glicano convenientemente aparece efetivamente imitar interfaces de celular. Para enriquecer a tecnologia e a superar a questão desigual associada com formatos de matriz convencional, nosso grupo desenvolveu recentemente um glicano matriz sobre uma lâmina de vidro revestido de óxido de alumínio (ACG) usando os glicanos de terminou de ácido fosfônico para aumentar a intensidade do sinal, homogeneidade e sensibilidade19,20.

Para melhorar o entendimento atual sobre glicano epitopos de HIV-1 recém isoladas amplamente neutralizando anticorpos (bNAbs), temos desenvolvido uma estratégia modular altamente eficiente para a preparação de um vasto leque de N-ligados os glicanos21 ,22 para serem impressos em um ACG deslize (ver Figura 1). Especificidade de estudos de perfil de bNAbs de HIV-1 em uma matriz ACG ofereceram a detecção incomum de comportamento de vinculação de hetero-glicano de bNAb altamente potente PG9 que foi isolado do HIV infectados indivíduos23,24,25.

Protocol

1. preparação de D1/D2 braço módulos22 Preparação de intermediário 2 Pesar a partir de material 1 (mostrado na Figura 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 mmol)) em um tubo de 15 mL e dissolver em Tris tampão (25 mM, pH 7,5) contendo dicloreto de manganês (MnCl2, 10mm) para obter uma concentração final de glicano de 5…

Representative Results

Uma estratégia modular de quimio-enzimático para a síntese de um vasto leque de N-os glicanos é apresentada na Figura 1. A estratégia é baseado no fato de que a diversidade pode ser criada no início por quimioterapia-enzimático síntese dos três módulos importantes, seguido pelo mannosylation α-específicos para o 3-O e/ou 6-Ó posição do resíduo manose do comum núcleo trissacarídeo de N- os glicanos. Consid…

Discussion

Uma classe de bNAbs de HIV-1, incluindo PG9 e PG16 PGTs 128, 141-145 foram relatados para ser altamente potente para neutralizar a 70-80% de isolados de HIV-1 em circulação. Os epítopos destes bNAbs são altamente conservados entre as variantes de todo o grupo HIV-1 M, portanto eles podem guiar o projeto de immunogen eficaz para uma vacina contra o HIV eliciar neutralizando anticorpos23,24,25 . Como parte dos nossos esforços…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Os autores graças a divisão de tecnologia de película fina, centro de pesquisa de tecnologia de instrumento (ITRC) e nacional aplicada Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan. Este trabalho foi financiado pelo Conselho Nacional de ciência (conceder n. A maioria dos 105-0210-01-13-01) e Academia Sinica.

Materials

Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521
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References

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Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C., Wong, C. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).
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