Химио ферментативного синтеза N- гликанов массив развития и антител ВИЧ профилирования
Summary
Модульный подход к синтезу N– гликанов для крепления к оксида алюминия покрытием стекла слайд (ACG слайд) как glycan microarray был разработан и его использование для профилирования широко нейтрализующих антител ВИЧ была продемонстрирована.
Abstract
Мы представляем очень эффективный способ для быстрой подготовки широкого круга N-связанных олигосахариды (по оценкам превышает 20 000 структур), которые обычно встречаются на человеческих гликопротеинов. Для достижения желаемого структурного разнообразия, стратегии началось с химио ферментативный синтез трех видов oligosaccharyl фторид модулей, следуют их поэтапного α-селективного glycosylations на 3-O -6O позиции манноза остатки общих основных трисахариды, имеющие решающее значение β-mannoside связь. Далее мы придает N– гликанов поверхности оксида алюминия покрытием стекла (ACG) слайд для создания ковалентных смешанные массива для анализа взаимодействия гетеро лиганда с антитела ВИЧ. В частности поведение привязки вновь изолированных ВИЧ-1 широко нейтрализующих антител (bNAb), PG9, смесь близко расположенными человек5GlcNAc2 (5человек) и 2,6-ди sialylated Би antennary комплекс типа N– glycan (SCT ) на массив ACG, открывает новые возможности для руководства эффективным immunogen дизайн для разработки вакцины против ВИЧ. Кроме того наш массив ACG воплощает в себе мощный инструмент для изучения других антител на ВИЧ для привязки гетеро лиганд.
Introduction
N– гликанов на гликопротеинов ковалентно связаны с аспарагин (Asn) остатки Asn-Xxx-Ser/Чет sequon консенсуса, которые затрагивают несколько биологических процессов, как белка конформации, антигенностью, растворимость и Лектин признание 1 , 2. Химический синтез N-связанных олигосахариды представляет собой значительный вызов синтетических из-за их огромные структурной неоднородности микро и весьма разветвленной архитектуры. Тщательный отбор защиты групп для настройки реактивности строительных блоков, достижения селективности в anomeric центрах и надлежащего использования промоутер / activator(s) являются ключевыми элементами в синтезе сложных олигосахариды. Для решения этой проблемы сложности, большой объем работы для продвижения N– glycan синтез сообщалось недавно3,4. Несмотря на эти надежные подходы находить эффективный метод для подготовки широкого круга N– гликанов (~ 20000) остается основной задачей.
Быстрой мутации ВИЧ-1 для достижения обширные генетического разнообразия и его способность бежать от нейтрализации реакции антитела, составляет среди наиболее серьезных проблем для разработки безопасных и профилактической вакцины против ВИЧ-15,6 , 7. одна эффективная тактика, что ВИЧ использует, чтобы избежать иммунного ответа является столб-поступательные гликозилирования оболочки gp120 гликопротеин с разнообразной N-связаны гликаны, производные от принимающей гликозилирования машины8, 9. Недавний доклад относительно точный анализ рекомбинатных мономерных гликозилирования gp120 ВИЧ-1 от 293T клеток человеческого эмбриона почек (ГЭС) предполагает возникновение структурных микрогетерогенности с характерным клеток конкретных шаблон10 , 11 , 12. Таким образом, понимание специфики glycan ВИЧ-1 bNAbs требует хорошо характеризуется gp120 связанных с N– glycan структур в количестве, достаточном для анализа.
Открытие технологии microarray glycan условии высокой пропускной способности на основе изучение особенности широкий спектр углеводов связывающих белков, вирусы/бактериальных адгезины, токсинов, антител и lectines13,14 . Организация систематического гликанов в формате выстроились на основе чипа может определить проблематичным низкого сродства белка glycan взаимодействия через многовалентных презентация15,16,17,18. Этот механизм на основе чипа glycan удобно, как представляется, эффективно имитировать интерфейсы ячеек. Чтобы обогатить технологии и преодоления неравномерным проблема, связанная с обычными массив форматов, наша группа недавно разработали glycan массив на слайде оксида алюминия покрытием стекла (ACG), с помощью фосфоновая кислота закончился гликанов для повышения интенсивности сигнала, однородность и чувствительность19,20.
Для улучшения нынешнего понимания о glycan epitopes вновь изолированных ВИЧ-1 широко нейтрализующих антител (bNAbs), мы разработали стратегию высокоэффективная модульная для подготовки широкого спектра N-связаны гликанов21 ,22 быть напечатаны на ACG слайд (см. Рисунок 1). Специфика профилирования исследования ВИЧ-1 bNAbs на массив АКГ предложили необычные обнаружения гетеро glycan поведение привязки сильнодействующим bNAb PG9, который был изолирован от ВИЧ инфицированных лиц23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
Класс bNAbs ВИЧ-1, включая PG9, PG16 и PGTs 128, 141-145 были сообщается сильнодействующим в нейтрализации 70-80% циркулирующих изолятов ВИЧ-1. Среди вариантов всей группы ВИЧ-1 M высоко сохраняются epitopes этих bNAbs, поэтому они могут вести эффективную immunogen дизайн для вакцины против ВИЧ для получения нейтрал?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят тонких разделения фильме технологии, инструмент технологии исследовательский центр (ITRC) и национальных применяется научно-исследовательских лабораторий, парк науки Синьчжу, Тайвань. Эта работа была поддержана национального научного Совета (Грант нет. Большинство 105-0210-01-13-01) и Синика.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
References
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
- Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
- Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
- Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
- Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
- Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
- Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
- Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
- Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
- Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
- Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
- Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
- Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
- Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
- Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
- Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
- Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
- Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
- McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
- Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
- Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
- de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).
