Kemo-enzymatisk syntes av N- glycans för Array utveckling och HIV-antikroppar profilering
Summary
Ett modulärt tillvägagångssätt till syntesen av N– glycans för fastsättning på en aluminiumoxid-belagda glas Skjut (ACG bild) som en glycan microarray har utvecklats och dess användning för profilering av en HIV i stort sett neutraliserande antikropp har påvisats.
Abstract
Vi presenterar ett mycket effektivt sätt för snabb beredning av ett brett utbud av N-länkade oligosackarider (beräknas överstiga 20.000 strukturer) som ofta finns på människans glykoproteiner. För att uppnå den önskade strukturella mångfalden, strategin började med kemo-enzymatisk syntesen av tre sorters oligosaccharyl fluor moduler, följt av deras stegvis α-selektiv Glykosyleringar på 3-O och 6-O placerar av den mannos rester av den gemensamma kärnan trisaccharide att ha en avgörande β-mannoside koppling. Vi ytterligare bifogas den N– glycans ytan av en aluminiumoxid-belagda glas (ACG) bild vill skapa en kovalent blandade matris för analys av hetero-ligand interaktion med en HIV-antikroppar. I synnerhet typ bindande beteende nyligen isolerade HIV-1 i huvudsak neutraliserande antikroppar (bNAb), PG9, blandning av tättliggande Man5GlcNAc2 (mannen5) och 2,6-di-sialylated bi-antennary komplex N– glycan (SCT ) på en ACG matris, öppnar en ny väg för att vägleda den effektiva immunogen designen för HIV vaccinutveckling. Dessutom förkroppsligar våra ACG matrisen ett kraftfullt verktyg för att studera andra HIV-antikroppar för hetero-ligand bindande beteende.
Introduction
N– glycans på glykoproteiner är kovalent kopplade till asparagin (Asn) rester av de samförstånd Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, som påverkar flera biologiska processer såsom protein konformation, antigenicitet, löslighet och lectin erkännande 1 , 2. den kemiska syntesen av N-länkade oligosackarider representerar en betydande syntetiska utmaning på grund av deras enorma strukturella micro heterogenitet och mycket förgrenade arkitektur. Noggrant urval av skydda grupper för att finjustera Reaktiviteten hos byggstenar, att uppnå selektivitet vid anomera centers och korrekt användning av arrangören / activator(s) är nyckelfaktorer i syntes av komplexa oligosackarider. För att lösa problemet av komplexitet, en stor mängd arbete att avancera N– glycan syntes rapporterades nyligen3,4. Trots dessa robusta metoder, att hitta en effektiv metod för beredning av ett brett utbud av N– glycans (~ 20 000) återstår en stor utmaning.
Den snabba mutationshastighet för HIV-1 att uppnå omfattande genetiska mångfalden och dess förmåga att fly från neutraliserande antikroppssvar, är bland de största utmaningarna att utveckla en säker och profylaktiskt vaccin mot HIV-1-5,6 , 7. en effektiv taktik som HIV använder för att undvika värd immunsvaret är den post-translationella glycosylation av kuvert glykoprotein gp120 med en olika N-länkade glycans härrör från värd glycosylation maskiner8, 9. En färsk rapport angående exakt analys av rekombinant monomer HIV-1 gp120 glycosylation från mänskliga embryonala njurar (HEK) 293T celler tyder på förekomsten av strukturella microheterogeneity med en karakteristisk-specifika mönster10 , 11 , 12. därför förståelse glycan särdragen hos HIV-1 bNAbs kräver väl karakteriserade gp120 med N– glycan strukturer i en mängd som är tillräcklig för analys.
Upptäckten av glycan Mikroarrayteknik förutsatt hög genomströmning-baserade utforskning av särdrag av ett varierat utbud av kolhydrat-bindande proteiner, virus/bakterie adhesiner, toxiner, antikroppar och lectines13,14 . Den systematiska glycans arrangemanget i en klädd chip-baserat format kunde avgöra problematiska låg affinitet protein-glycan interaktioner genom multivalenta presentation15,16,17,18. Detta chip-baserade glycan arrangemang visas bekvämt att effektivt efterlikna cell cell gränssnitt. För att berika tekniken och övervinna den ojämna frågan som är associerad med konventionella array format, utvecklat vår grupp nyligen en glycan matris på en aluminiumoxid-belagda glas (ACG) bild med fosfonsyraderivat syra-slutade glycans för att öka signal intensiteten, homogenitet och känslighet19,20.
För att förbättra den nuvarande förståelsen om glycan epitoper av nyligen isolerade HIV-1 i huvudsak neutraliserande antikroppar (bNAbs), har vi utvecklat en mycket effektiv modulär strategi för beredning av ett brett spektrum av N-länkade glycans21 ,22 ska skrivas på en ACG Skjut (se figur 1). Specificitet profilering studier av HIV-1 bNAbs på en ACG array erbjuds ovanlig upptäckt av hetero-glycan bindande beteende mycket potent bNAb PG9 som isolerades från HIV-infekterade individer23,24,25.
Protocol
Representative Results
Discussion
En klass av HIV-1 bNAbs inklusive PG9, PG16 och PGTs 128, 141-145 rapporterades vara mycket potent i neutraliserande 70-80% av cirkulerande HIV-1 isolat. Epitoper av dessa bNAbs bevaras mycket bland varianterna av den hela HIV-1 gruppen M, därför de kan vägleda den effektiva immunogen designen för ett HIV-vaccin att framkalla neutraliserande antikroppar23,24,25 . Som en del av våra pågående ansträngningar för att identi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar tunn Film Technology-divisionen, Instrument teknik forskning Center (ITRC) och nationella tillämpas forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Detta arbete stöds av National Science Council (bevilja nr. De flesta 105-0210-01-13-01) och Academia Sinica.
Materials
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
| Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
| Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
| Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
| Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
| Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
| Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
| β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
| BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
| Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
| Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
| Clean glass slide | Schott | ||
| Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
| Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
| Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
| Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
| Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
| Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
| FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
| Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
| Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
| GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
| GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
| Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
| Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
| N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
| Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
| Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
| P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
| Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
| Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
| Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
| Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
| Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
| Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
| Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |
References
- Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
- Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
- Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
- Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
- Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
- Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
- Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
- Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
- Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
- Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
- Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
- Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
- Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
- Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
- Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
- Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
- Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
- Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
- Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
- Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
- McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
- Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
- Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , (2017).
- de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes?. J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , (2017).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , (2017).
- Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
- Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
- . . GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , (2017).
