PIP-on-a-chip : 단백질 - 포스 포이 노시 티드 상호 작용에 대한 라벨없는 연구
Summary
여기서 우리는 pH 조절에 기반한 라벨없는 방법을 사용하여 단백질 – 포스 포이 노시 티드 상호 작용을 연구하기위한 마이크로 유체 플랫폼의 맥락에서지지 된 지질 이중층을 제시합니다.
Abstract
수많은 세포 단백질이 막 표면과 상호 작용하여 필수 세포 과정에 영향을줍니다. 이러한 상호 작용은 phosphoinositides (PIPs)의 경우처럼 특정 세포 내 지방화 및 / 또는 활성화를 보장하기 위해 멤브레인 내의 특정 지질 성분을 향하게 할 수 있습니다. PIP와 세포질 PIP 결합 도메인은 세포 생리학에서 그들의 역할을 더 잘 이해하기 위해 광범위하게 연구되어 왔습니다. 우리는 protein-PIP 상호 작용을 연구하기위한 도구로서지지 된 지질 이중층 (SLBs)에 pH 조절 분석을 적용했습니다. 이 연구에서, pH 민감성 ortho- sulforhodamine B conjugated phosphatidylethanolamine은 protein-PIP 상호 작용을 검출하는 데 사용됩니다. 단백질이 PIP 함유 멤브레인 표면에 결합하면, 계면 전위가 조절되어 ( 즉 , 국소 pH 변화), 프로브의 양성자 화 상태가 변하게됩니다. pH 조절 분석의 성공적인 사용에 대한 사례 연구는 phospholipase C delta1 Pleckstr상동 (PLC-δ1의 PH) 도메인 및 예로서, 포스파티딜 이노시톨 -4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)의 상호 작용이다. 이 상호 작용에 대한 겉보기 해리 상수 ( K d, app )는 0.39 ± 0.05 μM이었고 , 다른 것들에 의해 얻어진 K d 값과 유사했다. 이전에 관찰 된 바와 같이, PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 특이 적이며, 포스파티딜 이노시톨 4- 인산염에 대한 약한 결합을 나타내며, 순수한 포스파티딜콜린 SLB에 대한 결합은 보이지 않는다. PIP-on-a-chip 분석은 낮은 샘플 부피 및 리간드 / 수용체 표지 요구 사항이 없지만 작은 및 낮은 친화도 막 상호 작용을 테스트 할 수있는 능력을 포함하되 이에 국한되지 않는 전통적인 PIP 결합 분석보다 유리합니다. 큰 분자 및 개선 된 신호 대 잡음비. 따라서, PIP-on-a-chip 접근법의 사용은 광범위한 막 상호 작용 메커니즘의 해명을 용이하게 할 것이다. 또한이 방법은 잠재적으로세포막과 상호 작용할 수있는 단백질의 능력을 조절하는 치료제를 확인하는데있어
Introduction
무수한 상호 작용과 생화학 적 과정은 2 차원 유체 막 표면에서 일어난다. 진핵 세포의 멤브레인 – 둘러싸인 세포 기관은 생화학 적 과정과 관련 프로테옴뿐만 아니라 지질 조성에서도 독특합니다. 예외적으로 인지질의 한 종류는 phosphoinositides (PIPs)입니다. 이들이 세포질 리피도미스의 1 %만을 차지한다고 할지라도, 이들은 신호 변환,자가 식욕 (autophagy), 막 인신 매매 (membrane trafficking)에서 중요한 역할을한다. 그 중에서도 1 , 2 , 3 , 4 가 중요하다. 셀룰러 PIP 키나제하여 이노시톨 헤드 그룹의 동적 인산화 일곱 PIP 모노있다 headgroups, 비스 -, 또는 트리스 – (5)의 인산화를 일으킨다. 또한, PIP는 세포막의 세포 내 신원을 정의하고 하나 이상의 포스 포이 노를 함유하는 단백질 / 효소에 대한 특화된 막 도킹 사이트로서 작용한다예를 들어, 도메인을 itide 결합, 플렉스 트린 상 동성 (PH) Phox 동성 (PX)과 epsin N 말단 동성 (ENTH) 6,7. 가장 많이 연구 된 PIP 결합 도메인 중 하나는 특히 높은 나노 몰 낮은 마이크로 몰 범위의 친 화성 8에서 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PI (4,5) P 2)과 상호 작용하는 포스 포 리파제 C (PLC) -δ1의 PH 도메인이고 , 9 , 10 , 11 .
다양한 정성 및 정량 시험관 방법이 개발되어 이러한 상호 작용의 메커니즘, 열역학 및 특이성을 연구합니다. 가장 일반적으로 사용되는 PIP 결합 분석에는 표면 플라스 몬 공명 (SPR), 등온 열량계 (ITC), 핵 자기 공명 (NMR) 분광기, 리포좀 부유 / 침강 분석법 및 지질 블롯 (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . 이것들이 광범위하게 이용 되더라도 그들은 모두 많은 단점을 가지고 있습니다. 예를 들어, SPR, ITC 및 NMR은 많은 양의 시료, 값 비싼 계측 및 / 또는 숙련 된 인원 12 , 13을 필요로 합니다. 항체 기반 lipid-blots와 같은 일부 분석 형식은 PIP의 수용성 형태를 사용하고 비 생리 학적 방식으로 12 , 14 , 15 , 16로 표시 합니다. 또한, 지질 블롯은 신뢰할 수있게 정량 될 수 없으며 종종 가양 성 / 음성 관찰 12 , 17 , 18을 초래합니다. 이러한 어려움을 극복하고 현재 도구 세트를 개선하기 위해 지원되는 지질 이중층 (lipid bilayer, SLB)을 기반으로 새로운 라벨없는 방법이 am ( 그림 1 ) 19 단백질 – PIP 상호 작용의 연구에 성공적으로 적용된 마이크로 유체 플랫폼.
단백질 -PIP 상호 작용을 검출하기 위해 사용 된 전략은 pH 변조 감지에 기초한다. 이것은 phosphatidylethanolamine lipid head group 20에 직접 conjugated ortho -sulforhodamine B ( o SRB)가있는 pH 민감성 염료를 포함합니다. 오의 SRB-POPE 프로브 (도 2a)는 낮은 pH에서 높은 형광 및 7.5 몰 %의 PI (4,5) P (2) 함유 SLB 수 (도 5b)에서 약 6.7의 pKa 높은 pH에서 켄칭된다. PLC-δ1 PH 도메인은 PI (4,5) P 2 ( 도 5A )에 대한 높은 특이성으로 인해 단백질 -IP 결합 방법의 유효성 확인에 광범위하게 사용되어왔다 ( 도 5A ) 21 , 22 ,"> 23, 24, 25 .Hence, 우리는 PLC-δ1의 PH 도메인은 그것의 PI 결합 테스트하는데 사용될 수 있다는 추론 (4,5)가 PIP 온 칩 분석을 통해 P 2. 산도 도메인 구조 본 연구에서 사용은 순 양전하 PI (8.4)을 가지며, 따라서 OH 유치 -.받는 이온 – PI (4,5) P (2) 함유 SLB 수 결합시 이온 (도 5c)를 상기 PH 도메인은 OH를 가져온다 결과적으로 계면 전위를 변조하여 O SRB-POPE (도 5C) 26. 산도 도메인 농도의 함수로서, 형광 켄칭된다 (도 6A)의 양성자 화 된 상태를 시프트 막 표면. 최종적으로, 정규화 된 데이터는 산도 도메인 PI (4,5) P (2)의 상호 작용 (도 6b,도 6c).의 친 화성을 결정하기 위해 결합 등온선에 맞게 </ p>
이 연구에서는 미세 유체 플랫폼 내에서 PIP를 함유 한 SLB에 단백질 결합을 수행하기위한 상세한 프로토콜이 제공됩니다. 이 프로토콜은 독자가 microfluidic 장치와 소낭 준비를 SLB 형성과 단백질 바인딩으로 조립하는 것을 필요로합니다. 또한, 데이터 분석을위한 지시는 PLC-δ1의 PH 도메인-PI (4,5) P (2)의 상호 작용이 제공되는 선호도에 대한 정보를 추출한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
각각의 PIP 변이체는 저농도 임에도 불구하고 특정 세포 소기관의 세포질 표면에 존재하며, 세포막 고유의 물리적 구성과 기능적 특이성의 형성에 기여합니다 1 . PIP를의 가장 중요한 용도 중 하나는 특정 세포 내 현지화 및 / 또는 활성화 6, 7을 필요로하는 단백질의 다수에 대한 특정 도킹 플랫폼이다. 세포 생리학 및 질병에서의 역할?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DS 및 CEC는 부분적으로는 보조금 AI053531 (NIAID, NIH)에 의해 지원되었다. SS 및 PSC는 보조금 N00014-14-1-0792 (ONR)에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Coverslip | |||
| Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
| 7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
| PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
| Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
| PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
| Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
| Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
| Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mold | |||
| AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
| Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
| Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
| SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SUV | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
| Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
| Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
| Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
| Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
| LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
| Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Analysis | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
| AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
| X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
| Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
| AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 기타 | |||
| Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
| Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
| Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
| Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
| N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
| Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
| Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |
References
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