JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

PIP-on-a-chip: een labelvrije studie van eiwit-fosfoinositide-interacties

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Hier presenteren we een ondersteunde lipid bilayer in het kader van een microfluïdisch platform om eiwit-fosfoinositide interacties te bestuderen met behulp van een etiketvrije methode op basis van pH-modulatie.

Abstract

Talrijke cellulaire eiwitten interageren met membraanoppervlakken om essentiële cellulaire processen te beïnvloeden. Deze interacties kunnen gericht zijn op een specifieke lipidcomponent binnen een membraan, zoals bij fosfoinositiden (PIP's), om specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie te waarborgen. PIP's en cellulaire PIP-bindende domeinen zijn uitgebreid bestudeerd om hun rol in cellulaire fysiologie beter te begrijpen. We hebben een pH-modulatie-analyse toegepast op ondersteunde lipid bilayers (SLB's) als middel om eiwit-PIP-interacties te bestuderen. In deze studies wordt pH-gevoelige ortho- sulforhodamine B geconjugeerde fosfatidylethanolamine gebruikt om eiwit-PIP-interacties te detecteren. Bij binding van een eiwit aan een PIP-bevattend membraanoppervlak wordt het grensvlakpotentiaal gemoduleerd ( dwz verandering in lokale pH), waarbij de protonatietoestand van de probe wordt verplaatst. Een casestudy van het succesvolle gebruik van de pH-modulatie-analyse wordt gepresenteerd door gebruik te maken van fosfolipase C delta1 Pleckstrin Homologie (PLC-δ1 PH) domein en fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) interactie voorbeeld. De schijnbare dissociatieconstante ( Kd , app ) voor deze interactie was 0,39 ± 0,05 μM, vergelijkbaar met Kd , appwaarden verkregen door anderen. Zoals eerder opgemerkt, de PLC-δ1 PH domein PI (4,5) P2 bepaald, toont zwakkere binding aan fosfatidylinositol-4-fosfaat en geen binding aan zuiver fosfatidylcholine SLBs. De PIP-op-een-chip-analyse is voordelig boven de traditionele PIP-bindingsassays, waaronder maar niet beperkt tot een laag monstervolume en geen eisen voor ligand / receptor-etikettering, het vermogen om membraaninteracties met hoge en lage affiniteit te testen met zowel kleine als Grote moleculen, en verbeterde signaal-ruisverhouding. Bijgevolg zal het gebruik van de PIP-on-a-chip-aanpak het verhelderen van mechanismen van een breed scala van membraaninteracties vergemakkelijken. Bovendien kan deze methode u mogelijk zijnSed in identificerende therapieën die het vermogen van eiwit om met membranen te interageren moduleren.

Introduction

Myriade interacties en biochemische processen vinden plaats op tweedimensionale vloeistof membraanoppervlakken. Membraan-omsloten organellen in eukaryote cellen zijn uniek, niet alleen in biochemische processen en hun bijbehorende proteome maar ook in hun lipidsamenstelling. Een uitzonderlijke klasse fosfolipiden is fosfoinositiden (PIP's). Hoewel ze slechts 1% van het cellulair lipidoom omvatten, spelen ze een cruciale rol in signaaltransductie, autofagie en membraanhandel, onder andere 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische fosforylering van de inositol-hoofdgroep door cellulaire PIP-kinasen leidt tot zeven PIP-hoofdgroepen die mono-, bis- of trisfosforyleerd zijn 5 . Bovendien definiëren PIP's de subcellulaire identiteit van membranen en dienen als gespecialiseerde membraan docking sites voor proteïnen / enzymen die één of meer fosfoïnen bevattenBindende domeinen, bijvoorbeeld Pleckstrin Homology (PH), Phox Homology (PX) en epsin N-terminale Homology (ENTH) 6 , 7 . Een van de best bestudeerde PIP-bindende domeinen is fosfolipase C (PLC) -δ1 PH domein dat specifiek interageert met fosfatidylinositol 4,5-bisfosfaat (PI (4,5) P2) bij een hoge nanomolaire laag micromolaire gebied affiniteit 8 , 9 , 10 , 11 .

Er zijn verschillende kwalitatieve en kwantitatieve in vitro methoden ontwikkeld en gebruikt om het mechanisme, de thermodynamica en de specificiteit van deze interacties te bestuderen. Onder de meest gebruikelijke PIP-bindende assays zijn oppervlakte plasmon resonantie (SPR), isothermale calorimetrie (ITC), NMR-spectroscopie, liposome flotatie / sedimentatie assay en lipide-blots (Fat-blots / PIP-strips)12 , 13 . Alhoewel deze uitgebreid worden gebruikt, hebben ze allemaal veel nadelen. Bijvoorbeeld, SPR, ITC en NMR vereisen grote hoeveelheden monster, dure instrumentatie en / of getraind personeel 12 , 13 . Enkele assayformaten zoals antilichamen gebaseerde lipide-blots gebruiken wateroplosbare vormen van PIP's en presenteren ze op een nonfysiologische wijze 12 , 14 , 15 , 16 . Bovendien kunnen lipide-blots niet betrouwbaar worden gekwantificeerd en hebben ze vaak geleid tot valse positieve / negatieve waarnemingen 12 , 17 , 18 . Om deze uitdagingen te overwinnen en te verbeteren op de huidige gereedschapsset werd een nieuwe labelvrije methode op basis van een ondersteunde lipid bilayer (SLB) opgesteld in het kader van am Microfluidisch platform, dat succesvol werd toegepast op de studie van eiwit-PIP-interacties ( Figuur 1 ) 19 .

De strategie die wordt gebruikt voor het detecteren van eiwit-PIP-interacties is gebaseerd op pH-modulatie detectie. Dit omvat een pH-gevoelige kleurstof die ortho- sulforhodamine B ( o SRB) direct geconjugeerd is met fosfatidylethanolamine lipide hoofdgroep 20 . O SRB-POPE probe (Figuur 2A) is sterk fluorescerende bij lage pH en geblust bij hoge pH met een pKa ongeveer 6,7 bij 7,5 mol% PI (4,5) P2 bevattende SLBs (Figuur 5B). PLC-δ1 PH domein is uitgebreid gebruikt voor het valideren eiwit-PIP-bindende methoden vanwege de hoge specificiteit voor PI (4,5) P2 (figuur 5A) 21, 22,"> 23, 24, 25 .Hence, redeneerden we dat de PLC-δ1 PH-domein kan worden gebruikt om te testen de binding aan PI (4,5) P2 via het PIP-on-a-chip assay. Het PH-gebied construct in deze studie gebruikte een netto positieve lading (pi 8,4), en daardoor aantrekt OH -. ionen (figuur 5C) bij binding aan PI (4,5) P2 bevattende SLBs, het PH domein brengt de OH – ionen aan de Membraanoppervlak, dat op zijn beurt het grensvlakpotentiaal moduleert en de protonatietoestand van o SRB-POPE ( Figuur 5C ) 26 verplaatst. Als een functie van de PH-domeinconcentratie wordt de fluorescentie uitgeblust ( Figuur 6A ). Ten slotte zijn de genormaliseerde gegevens passen bij een bindingsisotherm om de affiniteit van het PH-domein-PI (4,5) P2 interactie (Figuur 6B, 6C). bepalen </ P>

In deze studie wordt een gedetailleerd protocol verstrekt om eiwitbinding uit te voeren naar PIP-bevattende SLB's in een microfluïdisch platform. Dit protocol neemt de lezer van het samenstellen van het microfluïdische apparaat en de vesikelpreparatie op SLB-vorming en eiwitbinding. Bovendien aanwijzingen voor gegevensanalyse affiniteitinformatie voor PLC-δ1 PH domein-PI (4,5) P2 interactie verschaft extraheren.

Protocol

1. Reiniging van de glazen dekjes Verdun 7x Schoonmaakoplossing (zie Materialetafel ) 7-voudig met gedeïoniseerd water in een 100 mm diep borosilicaatglasschotel met een platte bodem en verhit het tot 95 ° C op een kookplaat voor 20 minuten of tot de bewolkte oplossing duidelijk wordt . OPMERKING: De oplossing wordt heet, gebruik voorzichtigheid om lichamelijk letsel te vermijden. De 7x Reinigingsoplossing is een eigengemaakt mengsel van hexasodium [oxido- [oxido (fosfonatooxy) fosfo…

Representative Results

We gebruikten de pH modulatie test om de PLC-δ1 PH domein PI-studie (4,5) P2 interactie in een PIP-on-a-chip micro-inrichting (figuur 1). Door middel van een gedetailleerd protocol hebben we aangetoond hoe u microfluidische apparaatcomponenten kunt voorbereiden en monteren, kleine unilamellaire vesicles (SUV's) maken ( Figuur 2 ), SLB's vormen binnen een apparaat ( Figuur 3 ) en …

Discussion

Elke PIP variant, zij het bij lage concentraties, is aanwezig op het cytosolische oppervlak van specifieke organellen, waar zij bijdragen aan de totstandbrenging van een unieke fysieke samenstelling en functionele specificiteit van het organellair membraan 1 . Een van de belangrijkste toepassingen van PIP's is als een specifiek docking platform voor de veelheid van eiwitten die specifieke subcellulaire lokalisatie en / of activatie 6 , 7</s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS en CEC werden gedeeltelijk ondersteund door subsidie ​​AI053531 (NIAID, NIH); SS en PSC werden ondersteund door subsidie ​​N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
기타
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. 생화학. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O’Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what’s in it for biomedical applications?. Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. 생화학. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Tags

Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
check_url/kr/55869?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image