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생체공학

PIP-on-a-Chip: Eine Label-freie Studie von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Hier präsentieren wir eine unterstützte Lipiddoppelschicht im Rahmen einer mikrofluidischen Plattform zur Untersuchung von Protein-Phosphoinositid-Wechselwirkungen unter Verwendung eines etikettfreien Verfahrens auf Basis der pH-Modulation.

Abstract

Zahlreiche zelluläre Proteine ​​wechselwirken mit Membranoberflächen, um essentielle zelluläre Prozesse zu beeinflussen. Diese Wechselwirkungen können auf eine spezifische Lipidkomponente innerhalb einer Membran gerichtet sein, wie im Fall von Phosphoinositiden (PIPs), um eine spezifische subzelluläre Lokalisation und / oder Aktivierung zu gewährleisten. PIPs und zelluläre PIP-bindende Domänen wurden intensiv untersucht, um ihre Rolle in der zellulären Physiologie besser zu verstehen. Wir haben einen pH-Modulationstest auf geträgerten Lipiddoppelschichten (SLBs) als ein Werkzeug zur Untersuchung von Protein-PIP-Wechselwirkungen angewendet. In diesen Studien wird pH-sensitives ortho- Sulforhodamin B-konjugiertes Phosphatidylethanolamin verwendet, um Protein-PIP-Wechselwirkungen zu detektieren. Nach der Bindung eines Proteins an eine PIP-haltige Membranoberfläche wird das Grenzflächenpotential moduliert ( dh Änderung des lokalen pH-Werts), wobei der Protonierungszustand der Sonde verschoben wird. Eine Fallstudie der erfolgreichen Verwendung des pH-Modulationstests wird unter Verwendung von Phospholipase C delta1 PleckstrIn der Homologie (PLC-δ1 PH) -Domäne und Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2 ) -Interaktion als Beispiel. Die scheinbare Dissoziationskonstante ( Kd, app ) für diese Wechselwirkung betrug 0,39 ± 0,05 μM, ähnlich Kd, app- Werte, die von anderen erhalten wurden. Wie bereits erwähnt, ist die PLC-δ1-PH-Domäne PI (4,5) P 2 spezifisch, zeigt eine schwächere Bindung an Phosphatidylinositol-4-phosphat und keine Bindung an reine Phosphatidylcholin-SLBs. Der PIP-on-a-Chip-Assay ist gegenüber herkömmlichen PIP-Bindungsassays vorteilhaft, einschließlich, aber nicht beschränkt auf niedrige Probenvolumina und keine Ligand / Rezeptor-Markierungsanforderungen, die Fähigkeit, hoch- und niederaffine Membran-Wechselwirkungen sowohl mit kleinen als auch mit testen zu testen Große Moleküle und ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis. Dementsprechend wird die Verwendung des PIP-on-a-Chip-Ansatzes die Aufklärung von Mechanismen einer breiten Palette von Membranwechselwirkungen erleichtern. Darüber hinaus könnte diese Methode möglicherweise u seinSed bei der Identifizierung von Therapeutika, die die Fähigkeit des Proteins modulieren, mit Membranen zu interagieren.

Introduction

Unzählige Wechselwirkungen und biochemische Prozesse finden auf zweidimensional flüssigen Membranoberflächen statt. Membran-umschlossene Organellen in eukaryotischen Zellen sind nicht nur in biochemischen Prozessen und ihrem assoziierten Proteom, sondern auch in ihrer Lipidzusammensetzung einzigartig. Eine außergewöhnliche Klasse von Phospholipiden ist Phosphoinositide (PIPs). Obwohl sie nur 1% des zellulären Lipidoms enthalten, spielen sie eine entscheidende Rolle bei der Signaltransduktion, Autophagie und Membranhandel unter anderem 1 , 2 , 3 , 4 . Dynamische Phosphorylierung der Inositol – Kopfgruppe durch zelluläre PIP – Kinasen führt zu sieben PIP – Kopfgruppen , die Mono-, Bis- oder Tris-phosphoryliert 5. Zusätzlich definieren PIPs die subzelluläre Identität von Membranen und dienen als spezialisierte Membran-Docking-Stellen für Proteine ​​/ Enzyme, die ein oder mehrere Phosphoinos enthaltenItide-bindende Domänen, z. B. Pleckstrin-Homologie (PH), Phox-Homologie (PX) und Epsin-N-terminale Homologie (ENTH) 6 , 7 . Eine der am besten untersuchten PIP-bindenden Domänen ist Phospholipase C (PLC) -δ1 PH-Domäne, die spezifisch mit Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PI (4,5) P 2 ) innerhalb einer hohen Nanomolar-niedrigen Mikromolarbereich-Affinität 8 wechselwirkt , 9 , 10 , 11

Eine Vielzahl von qualitativen und quantitativen in vitro Methoden wurden entwickelt und verwendet, um den Mechanismus, die Thermodynamik und die Spezifität dieser Wechselwirkungen zu untersuchen. Zu den am häufigsten verwendeten PIP-Bindungsassays gehören die Oberflächenplasmonresonanz (SPR), die isotherme Kalorimetrie (ITC), die Kernspinresonanz (NMR) -Spektroskopie, der Liposom-Flotations- / Sedimentationsassay und die Lipidblots (Fat-Blots / PIP-Streifen)12 , 13 Auch wenn diese weitgehend genutzt werden, haben sie alle viele Nachteile. Zum Beispiel benötigen SPR, ITC und NMR große Mengen an Probe, teure Instrumentierung und / oder geschultes Personal 12 , 13 . Einige Assayformate wie Antikörper-basierte Lipid-Blots verwenden wasserlösliche Formen von PIPs und präsentieren sie in einer nichtphysiologischen Weise 12 , 14 , 15 , 16 . Darüber hinaus können Lipid-Blots nicht zuverlässig quantifiziert werden und haben oft zu falsch-positiven / negativen Beobachtungen 12 , 17 , 18 geführt . Um diese Herausforderungen zu bewältigen und den aktuellen Werkzeugsatz zu verbessern, wurde eine neue, etikettfreie Methode auf Basis einer unterstützten Lipiddoppelschicht (SLB) im Rahmen von am Mikrofluidische Plattform, die erfolgreich auf die Untersuchung von Protein-PIP-Wechselwirkungen angewendet wurde ( Abbildung 1 ) 19 .

Die zur Detektion von Protein-PIP-Wechselwirkungen eingesetzte Strategie basiert auf der pH-Modulationssensorik. Hierbei handelt es sich um einen pH-empfindlichen Farbstoff, der ortho- Sulforhodamin B ( o SRB) direkt an die Phosphatidylethanolamin-Lipidkopfgruppe 20 konjugiert hat. Die o SRB-POPE-Sonde ( Fig. 2A ) ist bei niedrigem pH-Wert hoch fluoreszierend und bei hohem pH-Wert mit einem pKa um 6,7 innerhalb von 7,5 Mol-% PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs abgeschreckt ( Fig. 5B ). PLC-δ1-PH-Domäne wurde für die Validierung von Protein-PIP-Bindungsmethoden aufgrund ihrer hohen Spezifität gegenüber PI (4,5) P 2 ( Abbildung 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Daher haben wir festgestellt, dass die PLC-δ1-PH-Domäne verwendet werden kann, um ihre Bindung an PI (4,5) P 2 durch den PIP-on-a-Chip-Assay zu testen. Das PH-Domänen-Konstrukt verwendet , das in dieser Studie eine positive Nettoladung (pI 8,4) hat, und so zieht OH -. Ionen (5C) auf zu PI (4,5) P 2 -haltigen SLBs Bindung bringt die PH – Domäne , die OH – Ionen zu dem Membranoberfläche, die wiederum das Grenzflächenpotential moduliert und den Protonierungszustand von o SRB-POPE verschiebt ( Abbildung 5C ) 26. Als Funktion der PH-Domänenkonzentration wird die Fluoreszenz abgeschreckt ( Abbildung 6A ). Schließlich sind die normierten Daten Zu einer bindenden Isotherme passt, um die Affinität der PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion zu bestimmen ( Abbildung 6B , 6C )/ P>

In dieser Studie wird ein detailliertes Protokoll bereitgestellt, um Proteinbindung an PIP-haltige SLBs innerhalb einer mikrofluidischen Plattform durchzuführen. Dieses Protokoll nimmt den Leser vom Zusammenbau der mikrofluidischen Vorrichtung und der Vesikelpräparation zur SLB-Bildung und Proteinbindung an. Zusätzlich werden Richtungen für die Datenanalyse zur Extraktion von Affinitätsinformationen für die PLC-δ1-PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion bereitgestellt.

Protocol

1. Reinigung der Glasdeckel 7x Reinigungslösung verdünnen (siehe Werkstofftabelle ) 7-fach mit entionisiertem Wasser in einer 100 mm tiefen Borsilikatglasschale mit flachem Boden und erhitze sie bis zu 95 ° C auf einer ebenen Heizplatte für 20 min oder bis die trübe Lösung klar wird . HINWEIS: Die Lösung wird heiß, Vorsicht, um Körperverletzungen zu vermeiden. Die 7x Reinigungslösung ist eine proprietäre Mischung aus Hexanatrium [oxido- [oxido (phosphonatooxy) phosphoryl] ox…

Representative Results

Wir verwendeten den pH-Modulationstest, um die PLC-δ1 PH-Domäne-PI (4,5) P 2 -Interaktion innerhalb eines PIP-on-a-Chip-Mikrodevals zu untersuchen ( Abbildung 1 ). Durch ein detailliertes Protokoll haben wir gezeigt, wie man mikrofluidische Gerätekomponenten vorbereitet und zusammensetzt, kleine unilamellare Vesikel (SUVs) bildet ( Abbildung 2 ), SLBs innerhalb einer Vorrichtung bilden ( Abbild…

Discussion

Jede PIP-Variante, wenn auch bei niedrigen Konzentrationen, liegt auf der zytosolischen Oberfläche spezifischer Organellen vor, wo sie zur Etablierung einer einzigartigen physikalischen Zusammensetzung und funktionellen Spezifität der organellaren Membran 1 beitragen. Eine der wichtigsten Verwendungen von PIPs ist eine spezifische Docking-Plattform für die Vielzahl von Proteinen, die eine spezifische subzelluläre Lokalisierung und / oder Aktivierung erfordern 6 ,<…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS und CEC wurden teilweise durch die Gewährung von AI053531 (NIAID, NIH) unterstützt; SS und PSC wurden durch die Erteilung von N00014-14-1-0792 (ONR) unterstützt.

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
기타
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
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References

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Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
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Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
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