पीआईपी-ऑन-ए-चिप: प्रोटीन-फॉस्फोइनॉसाइटिड इंटरैक्शन के लेबल-मुक्त अध्ययन
Summary
यहां हम पीएच मॉडुलन के आधार पर एक लेबल मुक्त पद्धति का उपयोग करते हुए प्रोटीन-फास्फाइनाइसाइटिड इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक माइक्रोफ्लुइडिक प्लेटफॉर्म के संदर्भ में एक समर्थित लिपिड बिलेयर पेश करते हैं।
Abstract
कई सेलुलर प्रोटीन आवश्यक सेलुलर प्रक्रियाओं को प्रभावित करने के लिए झिल्ली सतहों के साथ बातचीत करते हैं। इन परस्पर क्रियाओं को झिल्ली के भीतर एक विशिष्ट लिपिड घटक के लिए निर्देशित किया जा सकता है, जैसे कि फॉस्फोइनॉसेटिड (पीआईपी) के मामले में, विशिष्ट सबसेलुलर स्थानीयकरण और / या सक्रियण सुनिश्चित करने के लिए। सेलुलर फिजियोलॉजी में उनकी भूमिका को बेहतर ढंग से समझने के लिए पीआईपी और सेलुलर पीआईपी बाध्यकारी डोमेन का व्यापक अध्ययन किया गया है। हमने प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक उपकरण के रूप में समर्थित लिपिड बिलेयर (एसएलबी) पर पीएच मॉडुलन परख लागू किया है। इन अध्ययनों में, पीएच संवेदनशील ऑर्थो -Sulforhodamine बी संयुग्मित phosphatidylethanolamine प्रोटीन PIP बातचीत का पता लगाने के लिए किया जाता है। पीआईपी युक्त झिल्ली सतह पर एक प्रोटीन के बंधन पर, इंटरफेसियल क्षमता को संशोधित किया जाता है ( यानी स्थानीय पीएच में परिवर्तन), जांच के प्रोटोनेशन स्टेट को बदल दिया गया है। पीएच मॉडुलन परख के सफल उपयोग का एक केस स्टडी फॉस्फोलाइपस सी डेल्टा 1 प्लेकस्ट्रेट का उपयोग करके प्रस्तुत किया गया हैहोमोलॉजी (पीएलसी-डीडीए पीएच) डोमेन और फॉस्फेटिडाइलिनोजोलोल 4,5-बिस्फोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2 ) एक उदाहरण के रूप में बातचीत। इस बातचीत के लिए स्पष्ट हदबंदी स्थिर ( के डी, एपी ) 0.3 9 ± 0.05 माइक्रोग्राम था, जो कि के डी के समान है , दूसरों के द्वारा प्राप्त एप्लिकेशन मूल्य। जैसा कि पहले देखा गया है, पीएलसी-डीडीए पीएच डोमेन पीआई (4,5) पी 2 विशिष्ट है, फॉस्फेटिडाइलीनोजिटॉल 4-फॉस्फेट के प्रति कमजोर बाध्यकारी दिखाता है, और शुद्ध फास्फेटिडाइलकोलाइन एसएलबी के लिए कोई बाध्यकारी नहीं है। पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख परंपरागत पीआईपी बाध्यकारी assays पर फायदेमंद है, जिसमें कम नमूना मात्रा और लिगेंड / रिसेप्टर लेबलिंग आवश्यकताओं के लिए सीमित नहीं है, लेकिन छोटे और छोटे दोनों के साथ उच्च और निम्न-आत्मीयता झिल्ली का परीक्षण करने की क्षमता बड़े अणुओं, और शोर अनुपात में सुधार संकेत। तदनुसार, पीआईपी-ऑन-ए-चिप दृष्टिकोण के उपयोग से झिल्ली बातचीत की एक विस्तृत श्रृंखला के तंत्रों को स्पष्ट करने में मदद मिलेगी। इसके अलावा, यह विधि संभवत: आपको यू हो सकती हैसैद्धांतिकताओं की पहचान करने में जो प्रोटीन की झिल्ली के साथ बातचीत करने की क्षमता विनियमित।
Introduction
अनियंत्रित बातचीत और जैव रासायनिक प्रक्रियाएं दो-आयामी द्रव झिल्ली सतहों पर होती हैं। यूकेरियोटिक कोशिकाओं में झिल्ली-संलग्न ऑर्गेनल्स न केवल जैव रासायनिक प्रक्रियाओं और उनके संबंधित प्रोटीम में बल्कि उनके लिपिड संरचना में भी अद्वितीय हैं। फॉस्फोलिपिड का एक असाधारण वर्ग फॉस्फोइनॉसेटिड (पीआईपी) है। हालांकि सेलुलर लिपिडोम में केवल 1% शामिल हैं, हालांकि वे 1 , 2 , 3 , 4 के बीच सिग्नल ट्रांसडक्शन, फार्मेजी और झिल्ली तस्करी में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। सेलुलर पीआईपी किनेज द्वारा इनॉसिटॉल हेड ग्रुप के डायनेमिक फास्फोरायलेशन, मोनो, बीआईएस-या ट्राइस-फास्फोराइलेट 5 वाले सात पीआईपी हेडग्रुप को जन्म देती है। इसके अतिरिक्त, पीआईपी झिल्ली की कोशिकीय पहचान को परिभाषित करते हैं और प्रोटीन / एंजाइम्स के लिए विशेष झिल्ली डॉकिंग साइट्स के रूप में काम करते हैं जिसमें एक या एक से अधिक फोस्फाइनोसउदाहरण के लिए, प्लेक्स्टिन होमोलॉजी (पीएच), फॉक्स होमोलॉजी (पीएक्स), और इप्सिन एन-टर्मिनल होमोलॉजी (ईएनटीएच) 6 , 7 । सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किए गए पीआईपी-बाध्यकारी डोमेन में से एक फॉस्फोलाइपेस सी (पीएलसी) -डी 1 पीएच डोमेन है जो विशेष रूप से फॉस्फेटिडाइलीनोजिटोल 4,5-बिस्फोस्फेट (पीआई (4,5) पी 2 ) के साथ एक उच्च नैनो-डायलोलर-कम माइक्रोलोवर रेंज एक्सिनिटि 8 , 9 , 10 , 11
इन अंतःक्रियाओं के तंत्र, ऊष्मप्रवैगिकी और विशिष्टता का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो विधियों में कई गुणात्मक और मात्रात्मक विकसित किए गए हैं। सबसे अधिक इस्तेमाल किए गए पीआईपी बाध्यकारी assays में सतह plasmon अनुनाद (एसपीआर), isothermal calorimetry (आईटीसी), परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी, liposome प्लवनशीलता / अवसादन परख, और लिपिड ब्लास्ट (फैट ब्लास्ट / पीआईपी स्ट्रिप्स)12 , 13 हालांकि इनका बड़े पैमाने पर उपयोग किया जाता है, वे सभी के कई नुकसान हैं उदाहरण के लिए, एसपीआर, आईटीसी, और एनएमआर को बड़ी मात्रा में नमूना, महंगी इंस्ट्रूमेंटेशन और / या प्रशिक्षित कर्मचारी 12 , 13 की आवश्यकता होती है । एंटीबॉडी-आधारित लिपिड-ब्लोट्स जैसे कुछ परख फॉर्मेट पीआईपी के पानी के घुलनशील रूपों का उपयोग करते हैं और 12 , 14 , 15 , 16 को गैर-प्रायोगिक तरीके से पेश करते हैं। इसके अलावा, लिपिड-ब्लोट्स को मज़बूती से मात्रात्मक नहीं किया जा सकता है और वे अक्सर झूठे सकारात्मक / नकारात्मक टिप्पणियों 12 , 17 , 18 के परिणामस्वरूप हैं। इन चुनौतियों पर काबू पाने के लिए और मौजूदा टूल सेट पर सुधार करने के लिए, एक नया लेबल-मुक्त तरीका स्थापित लिपिड बिलेयर (एसएलबी) के आधार पर स्थापित किया गया था। आईसीआरओफ़्लुइडिक प्लेटफॉर्म, जो प्रोटीन-पीआईपी इंटरैक्शन ( चित्रा 1 ) 1 9 के अध्ययन के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था।
प्रोटीन-पीआईपी बातचीत का पता लगाने के लिए नियोजित रणनीति पीएच मॉडुलन सेंसिंग पर आधारित होती है। यह एक पीएच के प्रति संवेदनशील डाई कि ऑर्थो -Sulforhodamine बी (ओ एसआरबी) है सीधे phosphatidylethanolamine लिपिड सिर समूह से 20 संयुग्मित शामिल है। ओ SRB-POPE जांच ( चित्रा 2 ए ) कम पीएच पर अत्यधिक फ्लोरोसेंट है और पीईए के साथ उच्च पीएच पर 7.7 के आसपास 7.5 एमओएल% पीआई (4,5) पी -2- एसोसिएशन एसएलबी ( चित्रा 5 बी ) में बुझती है। पीआई (4,5) पी 2 ( चित्रा 5 ए ) 21 , 22 , की दिशा में इसकी उच्च विशिष्टता के कारण प्रोटीन-पीआईपी बाध्यकारी पद्धतियों को मान्य करने के लिए पीएलसी-डीडीए पीएच डोमेन का बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है ।"> 23 , 24 , 25 .इसलिए, हमने तर्क दिया कि पीएलसी-डीडीए PH डोमेन का प्रयोग पीआईपी (4,5) पी 2 के लिए पीआईपी-ऑन-ए-चिप परख के माध्यम से परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। पीएच डोमेन का निर्माण इस अध्ययन में उपयोग किए गए शुद्ध सकारात्मक चार्ज (पीआई 8.4) है, और इस तरह ओएच – आयनों ( चित्रा 5C ) को आकर्षित करता है। पीआई (4,5) पी 2- एसोसिएशन एसएलबी के लिए बंधन पर, पीएच डोमेन ओएच – आयनों को लाता है झिल्ली सतह, जो बारी-बारी से इंटरफेसिक क्षमता को व्यवस्थित करती है और ओ SRB-POPE ( चित्रा 5C ) की प्रोटोनेशन स्थिति को बदलती है 26. पीएच डोमेन एकाग्रता के एक समारोह के रूप में, प्रतिदीप्ति बुझती है ( चित्रा 6 ए )। अंत में, सामान्यीकृत डेटा पीएच डोमेन-पीआई (4,5) पी 2 इंटरेक्शन ( चित्रा 6 बी , 6 सी ) की आत्मीयता निर्धारित करने के लिए एक बाध्यकारी आईएसओआरएम फिट है।/ P>
इस अध्ययन में, एक माइक्रोफ़्लिडिक प्लेटफॉर्म के भीतर पीआईपी युक्त एसएलबी के लिए प्रोटीन बाध्यकारी करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल दिया गया है। यह प्रोटोकॉल रीडर को माइक्रोब्ल्लुइडिक डिवाइस और एससीबी गठन और प्रोटीन बाइंडिंग के लिए फेंक की तैयारी को जोड़ने से ले जाता है। इसके अलावा, पीएलसी- δ1 PH डोमेन-पीआई (4,5) पी 2 इंटरैक्शन के लिए एफ़िनिटी जानकारी निकालने के लिए डेटा विश्लेषण के लिए दिशा-निर्देश दिए गए हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रत्येक पीआईपी संस्करण, कम सांद्रता पर यद्यपि विशिष्ट ऑर्गेनल्स की साइटोसोलिक सतह पर मौजूद है, जहां वे ऑगनेलर झिल्ली 1 की एक अनूठी भौतिक संरचना और कार्यात्मक विशिष्टता की स्थापना में योगदा?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
डीएस और सीईसी का समर्थन, भाग में, अनुदान AI053531 (एनआईआईआईडी, एनआईएच) द्वारा किया गया था; एसएस और पीएससी को अनुदान N00014-14-1-0792 (ओएनआर) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Coverslip | |||
| Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
| 7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
| PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
| Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
| PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
| Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
| Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
| Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mold | |||
| AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
| Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
| Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
| SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SUV | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
| Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
| Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
| Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
| Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
| LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
| Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Analysis | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
| AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
| X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
| Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
| AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 기타 | |||
| Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
| Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
| Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
| Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
| N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
| Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
| Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |
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