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생체공학

PIP-on-a-chip: Uno studio privo di etichette delle interazioni proteine-fosfoinositide

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Qui presentiamo un bilingue lipidico supportato nel contesto di una piattaforma microfluidica per studiare le interazioni proteine-fosfoinositide usando un metodo senza etichetta basato sulla modulazione del pH.

Abstract

Numerose proteine ​​cellulari interagiscono con superfici di membrana per influenzare processi cellulari essenziali. Queste interazioni possono essere indirizzate verso una componente lipidica specifica all'interno di una membrana, come nel caso di fosfoinositide (PIP), per garantire una localizzazione e / o un'attivazione subcellulare specifica. PIPs e domini cellulari PIP-binding sono stati studiati in modo estensivo per comprendere meglio il loro ruolo nella fisiologia cellulare. Abbiamo applicato un saggio di modulazione del pH sui bilayers lipidici supportati (SLBs) come uno strumento per studiare le interazioni proteine-PIP. In questi studi è stata utilizzata la fosfatidiletiletilammina coniugata con orto- Solforodina B sensibile al pH per rilevare interazioni proteine-PIP. Dopo il legame di una proteina a una superficie di membrana contenente PIP, il potenziale di interfaccia è modulato ( cioè il cambiamento nel pH locale), spostando lo stato di protonazione della sonda. Un caso di studio sull'uso efficace del saggio di modulazione del pH è presentato utilizzando fosfolipasi C delta1 PleckstrIn omologia (PLC-δ1 PH) e fosfatidilinositolo 4,5-bisfosfato (PI (4,5) P 2 ) come esempio. L'apparente costante di dissociazione ( K d, app ) per questa interazione era 0,39 ± 0,05 μM, simile a K d, valori app ottenuti da altri. Come osservato in precedenza, il dominio del PLC-δ1 è PI (4,5) P 2 specifico, mostra un legame più debole verso fosfatidilinositolo 4-fosfato, e nessun legame con SLB di fosfatidilcolina pura. Il test PIP-on-a-chip è vantaggioso rispetto ai test tradizionali PIP-binding, tra cui, ma non limitati, il basso numero di campioni e nessun requisito di etichettatura del ligando / del recettore, la capacità di testare interazioni a membrane di alta e bassa affinità con piccole e Grandi molecole e un miglior rapporto segnale / rumore. Di conseguenza, l'utilizzo del metodo PIP-on-a-chip faciliterà la chiarificazione dei meccanismi di una vasta gamma di interazioni di membrana. Inoltre, questo metodo poteva essere uNel identificare le terapie che modulano la capacità della proteina di interagire con le membrane.

Introduction

Interazioni di microrganismi e processi biochimici avvengono su superfici a membrana bidimensionale fluida. Gli organelli racchiusi in membrana in cellule eucariotiche sono uniche non solo nei processi biochimici e nel loro proteome associato, ma anche nella loro composizione lipidica. Una classe eccezionale di fosfolipidi è fosfoinositide (PIP). Anche se comprendono solo l'1% del lipidome cellulare, essi svolgono un ruolo cruciale nella trasduzione del segnale, nell'autofagia e nel traffico di membrana tra gli altri 1 , 2 , 3 , 4 . La fosforilazione dinamica del gruppo testa inositolo per le cellule PIP chinasi dà origine a sette gruppi di capi PIP che sono mono-, bis-, o tris-fosforilati 5 . Inoltre, i PIP definiscono l'identità subcellulare delle membrane e servono come siti di ancoraggio a membrana specializzati per proteine ​​/ enzimi che contengono uno o più fosfoidiDomini leganti, ad esempio Homology Pleckstrin (PH), Phox Homology (PX) e Epsin N-terminal Homology (ENTH) 6 , 7 . Uno dei domini PIP-legame più studiati è fosfolipasi C (PLC) dominio PH -δ1 che interagisce specificamente con fosfatidilinositolo 4,5-bifosfato (PI (4,5) P 2) all'interno di un alto nanomolari-gamma bassa affinità micromolare 8 , 9 , 10 , 11 .

Sono stati sviluppati diversi metodi qualitativi e quantitativi in vitro e utilizzati per studiare il meccanismo, la termodinamica e la specificità di queste interazioni. Tra i più comuni metodi di rilascio PIP sono la risonanza plasmonica superficiale (SPR), la calorimetria isotermica (ITC), la spettroscopia magnetica nucleare (NMR), il test di flottazione / sedimentazione dei liposomi e le macchie lipidiche (grasso-blots / PIP-strips)12 , 13 . Anche se questi sono ampiamente utilizzati, tutti hanno molti svantaggi. Ad esempio, SPR, ITC e NMR richiedono grandi quantità di campioni, strumentazione costosa e / o personale addestrato 12 , 13 . Alcuni formati di analisi come i blot di lipidi a base di anticorpi utilizzano forme solubili in acqua di PIP e li presentano in modo non fisiologico 12 , 14 , 15 , 16 . Inoltre, le macchie lipidiche non possono essere quantificate in modo affidabile e spesso hanno portato a osservazioni false positivo / negativo 12 , 17 , 18 . Per superare queste sfide e migliorare l'attuale set di strumenti, è stato stabilito un nuovo metodo senza etichetta basato su un duplicato lipidico supportato (SLB) nel contesto di Piattaforma microfluidica, che è stata applicata con successo allo studio delle interazioni proteine-PIP ( Figura 1 ) 19 .

La strategia utilizzata per rilevare le interazioni proteine-PIP è basata sulla sensazione di modulazione del pH. Ciò comporta una tintura sensibile al pH che ha orto- solforodamina B ( o SRB) direttamente coniugata al gruppo tossico lipidico della fosfatidiletanolammina 20 . La sonda o SRB-PAPA (Figura 2A) è altamente fluorescente a pH basso e spenta a pH elevato con un pKa circa 6,7 entro 7,5 moli% PI (4,5) P 2 SLB -aventi (Figura 5B). Il dominio PH del PLC-δ1 è stato ampiamente utilizzato per la convalida delle metodologie di legame di proteine-PIP a causa della sua elevata specificità nei confronti di PI (4,5) P 2 ( Figura 5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Quindi, abbiamo ragionato che il dominio PL PLC-δ1 possa essere utilizzato per testare il suo legame a PI (4,5) P 2 attraverso il test PIP-on-a-chip. Utilizzata in questo studio ha una carica netta positiva (pI 8.4) e attrae quindi gli OH – ioni ( Figura 5C ). Quando si lega a SLB che contengono PI (4,5) P 2 , il dominio PH porta gli OH – ioni al La superficie della membrana, che a sua volta modula il potenziale di interfaccia e sposta lo stato di protonazione di o SRB-POPE ( Figura 5C ) 26. In funzione della concentrazione del dominio di PH, la fluorescenza viene fatta abbrutire ( Figura 6A ). Adatta ad un'isoterma legante per determinare l'affinità dell'interazione di PH-dominio-PI (4,5) P 2 ( Figura 6B , 6C ). </ P>

In questo studio viene fornito un protocollo dettagliato per eseguire la legame delle proteine ​​a SLB contenenti PIP all'interno di una piattaforma microfluidica. Questo protocollo prende il lettore dall'assemblaggio del dispositivo microfluidico e della preparazione della vescicola alla formazione di SLB e alla legatura delle proteine. Inoltre sono fornite indicazioni per l'analisi dei dati per estrarre le informazioni di affinità per l'interazione PLC-δ1 PH-dominio-PI (4,5) P 2 .

Protocol

1. Pulizia dei vetri di copertura Diluire la soluzione di pulizia 7x (vedi tabella dei materiali ) 7 volte con acqua deionizzata in un piatto di vetro borosilicato profondo da 100 mm con fondo piano e riscaldare fino a 95 ° C su una piastra calda a livello per 20 minuti o fino a che la soluzione nuvolosa diventa chiara . NOTA: la soluzione sarà calda, usa cautela per evitare lesioni corporali. La soluzione di pulizia 7x è una miscela proprietaria di esasodio [ossido- [ossido (fosfon…

Representative Results

Abbiamo utilizzato il saggio di modulazione del pH per studiare l'interazione di PL-δ1 domino-PI (4,5) P 2 all'interno di un microprocessore PIP-on-a-chip ( Figura 1 ). Attraverso un protocollo dettagliato, abbiamo dimostrato come preparare e assemblare componenti microfluidici del dispositivo, realizzare piccole vescicole unilamellare ( Figura 2 ), formare SLB all'interno di un dispositivo ( <strong clas…

Discussion

Ogni variante PIP, seppure a basse concentrazioni, è presente sulla superficie citosolica di organismi specifici in cui contribuiscono alla creazione di una composizione fisica e specificità funzionale della membrana organellare 1 . Uno degli usi più importanti di PIPs è come una piattaforma specifica di docking per la moltitudine di proteine ​​che richiedono localizzazione e / o attivazione subcellulare specifica 6 , 7 . A causa …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS e CEC sono stati sostenuti, in parte, dalla sovvenzione AI053531 (NIAID, NIH); SS e PSC sono stati sostenuti dalla sovvenzione N00014-14-1-0792 (ONR).

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
기타
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
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References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. 생화학. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O’Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what’s in it for biomedical applications?. Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. 생화학. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

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Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
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Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
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