PIP-on-a-chip: безвредное исследование взаимодействия протеин-фосфоинозитид
Summary
Здесь мы представляем поддерживаемый липидный бислой в контексте микрофлюидной платформы для изучения взаимодействия белок-фосфоинозитид с использованием метода без меток, основанного на модуляции рН.
Abstract
Многочисленные клеточные белки взаимодействуют с поверхностями мембран, чтобы влиять на существенные клеточные процессы. Эти взаимодействия могут быть направлены на конкретный липидный компонент внутри мембраны, как в случае фосфоинозитидов (ПГИ), для обеспечения специфической субклеточной локализации и / или активации. PIPs и клеточные PIP-связывающие домены были широко изучены, чтобы лучше понять их роль в клеточной физиологии. Мы применили анализ модуляции рН на поддерживаемых липидных бислоях (SLB) в качестве инструмента для изучения взаимодействия белка с PIP. В этих исследованиях для определения белково-PIP-взаимодействий используется рН-чувствительный орто- сульфоподадим B-конъюгированный фосфатидилэтаноламин. При связывании белка с поверхностью, содержащей PIP-мембрану, межфазный потенциал модулируется ( т. Е. Изменяется локальный рН), изменяя состояние протонирования зонда. Пример успешного использования анализа модуляции рН представлен с использованием фосфолипазы C delta1 PleckstrВ гомологии (PLC-δ1 PH) и фосфатидилинозитол 4,5-бисфосфат (PI (4,5) P 2 ). Очевидная константа диссоциации ( K d, app ) для этого взаимодействия составляла 0,39 ± 0,05 мкМ, аналогично K d, значениям приложения, полученным другими. Как было отмечено ранее, ПЛК-δ1 домен РНА PI (4,5) P 2 специфический, показывает более слабое не связывание по отношению к фосфатидилинозитолам 4-фосфата, а не связывание с чистым фосфатидилхолином SLBS. Анализ PIP-на-чипе является преимуществом по сравнению с традиционными анализами связывания PIP, включая, но не ограничиваясь ими, низкий объем образца и отсутствие требований к маркировке лигандов / рецепторов, способность тестировать взаимодействия с высокой и низкой аффинностью мембран как с малыми, так и с малыми Больших молекул и улучшенного соотношения сигнал / шум. Соответственно, использование подхода PIP-на-чипе облегчит выяснение механизмов широкого спектра мембранных взаимодействий. Кроме того, этот метод потенциально может бытьSed при идентификации терапевтических средств, которые модулируют способность белка взаимодействовать с мембранами.
Introduction
Мириады взаимодействий и биохимические процессы протекают на поверхности двумерных жидкостных мембран. Мембранные органеллы в эукариотических клетках уникальны не только в биохимических процессах и их ассоциированном протеоме, но также и в их составе липидов. Одним исключительным классом фосфолипидов является фосфоинозитиды (ПГИ). Несмотря на то, что они составляют лишь 1% клеточного липидома, они играют решающую роль в передаче сигналов, аутофагии и распространении мембран, среди прочих 1 , 2 , 3 , 4 . Динамическое фосфорилирование головной группы инозитола клеточными киназами PIP приводит к появлению семи головных групп PIP, моно-, бис- или трисфосфорилированных 5 . Кроме того, PIP определяют субклеточную идентичность мембран и служат специализированными местами для стыковки мембран для белков / ферментов, содержащих один или несколько фосфоиновНапример, гомологию Плекстрина (PH), гомологию Фокса (PX) и эпсиновую N-терминальную гомологию (ENTH) 6 , 7 . Одним из наиболее изученных PIP-связывающих доменов является домен фосфолипазы C (PLC) -δ1 PH, который специфически взаимодействует с 4,5-бисфосфатом фосфатидилинозитола (PI (4,5) P 2 ) в пределах сродства к высокому наномолярно-низкому микромолярному диапазону 8 , 9 , 10 , 11 .
Разработаны различные качественные и количественные методы in vitro и используются для изучения механизма, термодинамики и специфичности этих взаимодействий. Среди наиболее часто используемых анализов на PIP-связывание – поверхностный плазмонный резонанс (SPR), изотермическая калориметрия (ITC), спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР), липосомная флотация / седиментационный анализ и липид-блоты (Fat-blots / PIP-strip)12 , 13 . Несмотря на то, что они широко используются, все они имеют множество недостатков. Например, SPR, ITC и NMR требуют больших объемов выборки, дорогостоящих приборов и / или обученного персонала 12 , 13 . В некоторых форматах анализа, таких как липид-блоты на основе антител, используются водорастворимые формы ПГИ и представлены их нефизиологическим образом 12 , 14 , 15 , 16 . Кроме того, липидные пятна не могут быть надежно оценены количественно, и они часто приводили к ложным положительным / отрицательным наблюдениям 12 , 17 , 18 . Чтобы преодолеть эти проблемы и улучшить текущий набор инструментов, был создан новый метод без этикетки на основе поддерживаемого липидного бислоя (SLB) в контексте am icrofluidic платформы, который был успешно применен к изучению белок-ПУМ взаимодействий (Рисунок 1) 19.
Стратегия, используемая для обнаружения взаимодействий белок-PIP, основана на измерении модуляции pH. Это включает pH-чувствительный краситель, который имеет орто- сульфамодинамик B ( o SRB), непосредственно конъюгированный с группой 20 липидов липидов фосфатидилэтаноламина. Зонд o SRB-POPE ( рис. 2A ) сильно флуоресцентен при низком значении pH и гасит при высоком рН pKa около 6,7 в пределах 7,5 мол.% PI (4,5) P 2 -содержащих SLB ( рис. 5B ). PLC-δ1 домен PH широко используется для проверки методологий связывания белка с PIP из-за его высокой специфичности к PI (4,5) P 2 ( фиг.5A ) 21 , 22 ,"> 23 , 24 , 25. Мы полагали, что домен PLC-δ1 PH может быть использован для проверки его связывания с PI (4,5) P 2 с помощью анализа PIP-на-чипе. используемый в данном исследовании имеет суммарный положительный заряд (РI 8.4), и , следовательно , привлекает ОН -. ионы (рис 5с) После связывания с PI (4,5) P 2 отработанный SLBS, домен PH приносит ОН – ионов в Мембрана, которая, в свою очередь, модулирует межфазный потенциал и сдвигает состояние протонирования o SRB-POPE ( рис. 5C ) 26. В зависимости от концентрации домена PH флуоресценция гасится ( рис. 6A ). Наконец, нормированные данные Подходит для изотермы связывания для определения аффинности взаимодействия PH-домена-PI (4,5) P 2 ( рис. 6B , 6C ). </ Р>
В этом исследовании представлен подробный протокол для связывания белка с PIP-содержащими SLB в микрофлюидной платформе. Этот протокол позволяет читателю собирать микрожидкостное устройство и препарат везикул для образования SLB и связывания с белком. Кроме того, предоставляются направления для анализа данных для извлечения информации о сродстве для взаимодействия PLC-δ1 PH-PI (4,5) P 2 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Каждый вариант PIP, хотя и при низких концентрациях, присутствует на цитозольной поверхности конкретных органелл, где они способствуют установлению уникального физического состава и функциональной специфичности органелларной мембраны 1 . Одним из наиболее важных примене?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
DS и CEC были частично поддержаны грантом AI053531 (NIAID, NIH); SS и PSC поддерживались грантом N00014-14-1-0792 (ONR).
Materials
| Coverslip | |||
| Glass Coverslips: Rectangles | Fisher Scientific | 12-544B | 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass |
| 7X Cleaning Solution | MP Biomedicals | 976670 | Detergent |
| PYREX Crystallizing Dish | Corning | 3140-190 | Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700) |
| Sentry Xpress 2.0 | Paragon Industries | SC-2 | Kiln |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS | |||
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 4019862 | Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives |
| PYREX Desiccator | VWR | 89134-402 | Vacuum Rated |
| Biopsy punch | Harris | 15110-10 | Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Device | |||
| Plasma Cleaning System | PlasmaEtch | PE25-JW | 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged) |
| Digital Hot Plate | Benchmark | H3760-H | Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640) |
| Frosted Micro Slides | VWR | 48312-003 | Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mold | |||
| AutoCAD | Autodesk | v.2016 | Drafting software for the photomask design |
| Photomask | CAD/Art Services | N/A | Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services |
| Silicone Wafers | University Wafer | 1575 | Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness |
| SU-8 50 | MicroChem Corp. | N/A | Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property |
| SU-8 Developer | MicroChem Corp. | N/A | Penn State Nanofabrication Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SUV | |||
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine | Avanti Polar Lipids | 850457C | POPC |
| L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate | Avanti Polar Lipids | 840045X | PI4P |
| L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate | Avanti Polar Lipids | 840046X | PI(4,5)P2 |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine | Avanti Polar Lipids | 850757C | POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) | ThermoFisher Scientific | L-20 | Required for the synthesis of oSRB-POPE |
| pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) | In-house | N/A | In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013) |
| Glass Scintillation Vial | VWR | 66022-065 | 20 mL volume capacity |
| Aquasonic 250D | VWR | N/A | Ultrasonic Water Bath |
| Nuclepore Track-Etched Membranes | Whatman | 110605 | Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich |
| Chloroform | VWR | CX1054-6 | HPLC grade |
| LIPEX Extruder | Transferra Nanosciences | T.001 | LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder |
| Viscotek 802 DLS | Malvern Instruments | N/A | Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Data Analysis | |||
| GraphPad Prism | GraphPad Software | v.6 | Curve-fitting software for data analysis |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Axiovert 200M Epifluorescence Microscope | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Microscope |
| AxioCam MRm Camera | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Camera |
| X-Cite 120 | Excelitas Technologies | N/A | Light Source |
| Alexa 568 Filter Set | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Ex/Em 576/603 nm |
| AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software | Carl Zeiss Microscopy | N/A | Image Processing Software |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 기타 | |||
| Tips | VWR | 10034-132 | 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel |
| Tips | VWR | 53509-070 | 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel |
| Orion Star A321 pH meter | Thermo Scientific | STARA3210 | pH meter |
| Orion micro pH probe | Thermo Scientific | 8220BNWP | micro pH probe |
| N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) | VWR | VWRB30487 | HEPES, Free Acid |
| Sodium Chloride | VWR | BDH8014-2.5KGR | NaCl |
| Tubing | Allied Wire & Cable | TFT-200-24 N | Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color |
| Nitrogen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Oxygen Gas – Industrial | Praxair | N/A | Local Provider |
| Liquid Nitrogen | Praxair | N/A | Local Provider |
References
- Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
- Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796 (2011).
- Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
- Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
- Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
- Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
- Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
- Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
- Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. 생화학. 34 (49), 16228-16234 (1995).
- Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O’Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
- Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
- Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
- Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
- Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
- He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
- Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
- Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
- Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
- Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
- Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
- Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
- Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
- Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
- Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
- Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
- Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
- Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
- Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
- Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
- Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what’s in it for biomedical applications?. Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
- Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
- Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
- Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. 생화학. 16 (12), 2806-2810 (1977).
- Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
- Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
- Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
- Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
- Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
- Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
- Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
- Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
- Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
- Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
- Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
- Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
- Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
- Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
- Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
- Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
- Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
- Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
- Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
- Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
- Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).
