JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생체공학

PIP-on-a-chip: Protein-fosfoinositid Etkileşimlerinin Etiketsiz Bir Çalışması

Published: July 27, 2017
doi:
10.3791/55869
, , ,
1Department of Biochemistry and Molecular Biology,The Pennsylvania State University, 2Department of Chemistry,The Pennsylvania State University

Summary

Burada, pH modülasyonuna dayalı etiketsiz bir yöntem kullanarak protein-fosfoinositid etkileşimlerini incelemek için bir mikroakışkan platform bağlamında desteklenen bir lipid çift katmanı sunmaktayız.

Abstract

Çok sayıda hücresel protein, temel hücre proseslerini etkilemek için membran yüzeyleriyle etkileşir. Bu etkileşimler, spesifik subselüler lokalizasyon ve / veya aktivasyonu sağlamak için, fosfoinositidler (PIPs) durumunda olduğu gibi bir zar içerisinde spesifik bir lipid bileşenine yönlendirilebilir. PIP'ler ve hücresel PIP bağlanma alanları, hücresel fizyolojideki rollerini daha iyi anlamak için kapsamlı olarak incelenmiştir. Protein-PIP etkileşimlerini incelemek için bir araç olarak desteklenen lipid bilayerlere (SLB'ler) bir pH modülasyon testi uyguladık. Bu çalışmalarda, pH'ye duyarlı orto- Sülohodamin B konjuge fosfatidiletanolamin, protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılmıştır. Bir proteinin bir PIP içeren membran yüzeyine bağlanmasının ardından ara yüzey potansiyeli, probun proton durumunu değiştirerek modüle edilir ( yani , yerel pH'daki değişim). PH modülasyon tahlilinin başarılı bir şekilde kullanılmasına ilişkin bir vaka çalışması, fosfolipaz C delta1 PleckstrHomoloji (PLC-δ1 PH) etki alanı ve bir örnek olarak fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) etkileşim içinde. Bu etkileşim için görünür çözülme sabiti ( Kd , app ) , diğerleri tarafından elde edilen Kd , app değerlerine benzer olarak 0.39 ± 0.05 μM idi. Daha önce gözlemlendiği gibi, PLC-δ1 PH alanı, PI (4,5) P 2 spesifiktir, fosfatidilinositol 4-fosfata karşı daha zayıf bağlar ve saf fosfatidilkolin SLB'ye bağlanma göstermez. PIP-on-a-chip testi, düşük örnek hacmi ve ligand / reseptör işaretleme gereksinimleri olmaksızın, geleneksel ve düşük PIP bağlanma deneyleri karşısında avantajlıdır, yüksek ve düşük afiniteli membran etkileşimlerini hem küçük hem de Büyük moleküller ve geliştirilmiş sinyal / gürültü oranı. Buna göre, çip üzerinde PIP'in kullanılması, çok çeşitli membran etkileşim mekanizmalarının aydınlatılmasını kolaylaştıracaktır. Dahası, bu yöntem muhtemelenProteinlerin membranlarla etkileşime geçme kapasitesini modüle eden terapötiklerin belirlenmesinde sed.

Introduction

Sayısız etkileşimler ve biyokimyasal işlemler iki boyutlu sıvı zar yüzeylerinde gerçekleşir. Ökaryotik hücrelerdeki zarla kapalı organeller, sadece biyokimyasal süreçlerde ve bunlarla ilişkili proteomda değil aynı zamanda lipit kompozisyonlarında da eşsizdir. Fosfolipidlerin olağan dışı bir sınıfı fosfoinositidlerdir (PIP'ler). Hücresel lipidomun sadece% 1'ini oluşturmalarına rağmen, bunlar 1 , 2 , 3 , 4 diğerleri arasında sinyal iletiminde, otofajiyede ve zar ticaretinde çok önemli bir rol oynamaktadır. Hücresel PIP kinazlar tarafından inositol baş grubunun dinamik fosforilasyonu yedi PIP mono- ana grupları, bis- veya tris-fosforile 5 yol açar. Ek olarak, PIP'ler membranların subselüler kimliğini tanımlar ve bir veya daha fazla fosfoin içeren protein / enzimler için özel membran yerleştirme siteleri olarak görev yaparlarÖrneğin Pleckstrin Homolojisi (PH), Phox Homoloji (PX) ve epsin N-terminal Homolojisi (ENTH) 6 , 7 . En çok çalışılan PIP bağlayıcı bölgeleri biri, özellikle yüksek nanomolar düşük mikromolar afinite 8 içinde fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PI (4,5) P2) ile etkileşime giren fosfolipaz C (PLC) -δ1 PH olan , 9 , 10 , 11 .

Bu etkileşimlerin mekanizması, termodinamiği ve özgüllüğünü incelemek için çeşitli nitel ve nicel in vitro yöntemler geliştirilmiş ve kullanılmıştır. En sık kullanılan PIP bağlanma deneyleri arasında, yüzey plazmon rezonansı (SPR), izotermal kalorimetre (ITC), nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisi, lipozom flotasyonu / sedimentasyon testi ve lipid lekeleri (Yağ-lekeleri / PIP-şeritleri)12 , 13 . Bunlar yaygın olarak kullanılsa da, hepsinin dezavantajları var. Örneğin, SPR, ITC ve NMR, büyük numuneler, pahalı aletler ve / veya eğitilmiş personel 12 , 13 gerektirir . Antikor bazlı lipid lekeleri gibi bazı tahlil formatları, suda çözünür PIP'leri kullanır ve onları fizyolojik olmayan bir şekilde 12 , 14 , 15 , 16 olarak sunar . Buna ek olarak, lipid blotlar güvenilir miktarı edilemez ve sık sık yanlış pozitif / negatif gözlem 12, 17, 18 ile sonuçlanmıştır. Bu zorlukların üstesinden gelmek ve mevcut takım setini geliştirmek için am bağlamında desteklenen bir lipid katmanına (SLB) dayalı yeni bir etiketsiz yöntem geliştirildi Protein-PIP etkileşimlerinin çalışmasına başarıyla uygulanan bir mikroakışkan platform ( Şekil 1 ) 19 .

Protein-PIP etkileşimlerini saptamak için kullanılan strateji pH modülasyon algılamaya dayanmaktadır. Bu, fosfatidiletanolamin lipid başı grubu 20'ye direkt olarak konjuge edilmiş orto- Sulforhodamin B ( o SRB) içeren pH'ye duyarlı bir boya içerir. O SRB-POPE probu (Şekil 2A), düşük pH değerinde yüksek floresan ve% 7.5 mol PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS (Şekil 5B) içinde yaklaşık 6.7 bir pKa'ya sahip yüksek bir pH değerinde söndürülür. PLC δ1 PH nedeniyle PI (4,5) P2 (Şekil 5A) karşı yüksek özgüllük 21, 22 için yaygın olarak protein PIP bağlama yöntemleri doğrulamak için kullanılmıştır"> 23 , 24 , 25. Dolayısıyla, PLC-δ1 PH alanının PIP-on-a-chip analizi yoluyla PI (4,5) P 2'ye yapıştığını test etmek için kullanılabileceğini düşünüyoruz PH etki alanı yapısı Bu çalışmada kullanılan bir net pozitif yüke (pl 8.4) sahiptir ve bu nedenle, OH çeken -. iyonları – PI (4,5) P2 ihtiva eden SLBS bağlanma üzerine iyonları (Şekil 5C), PH, OH getirir bu da ara yüzey potansiyel modüle ve o SRB-Pope (Şekil 5C) 26. PH konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak, floresan söndürülür (Şekil 6A) protonasyon durumunu değiştirir zar yüzeyi. Son olarak, normalleştirilmiş verileri PH-PI (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 6B, 6C). afinitesini belirlemek için bir bağlanma izoterm uyacak </ P>

Bu çalışmada, mikroakışkan bir platformda PIP içeren SLB'lere proteinin bağlanmasını gerçekleştirmek için ayrıntılı bir protokol sağlanmıştır. Bu protokol, okuyucuyu, mikroakışkan cihaz ve vezikül hazırlamadan SLB oluşumuna ve protein bağlamaya monte etmekten alıyor. Buna ek olarak, veri analizi için tarifi PLC δ1 PH-PI (4,5) P2 etkileşimi sağlanır için afinite bilgileri elde etmek.

Protocol

1. Cam Kapak Halkalarını Temizleme 7x Temizleme Çözeltisini ( Malzeme Tablosuna bakın) seyreltin, 100 mm derinliğinde borosilikatlı bir cam tabakasında deiyonize suyla 7 kez seyreltin ve düz bir tabanı olan bir tabakta 95 ° C'ye kadar 20 dakika boyunca veya bulutlu çözelti berraklaşana kadar ısıtın . NOT: Çözüm sıcak olacaktır, bedensel yaralanmaları önlemek için dikkatli olun. 7x Temizleme Çözeltisi, hekzasodyum [oksido- [oksido (fosfonatooksi) fosforil]…

Representative Results

Bir PIP-on-a-chip mikrocihazda içinde (4,5) P2 etkileşimi (Şekil 1), PLC-δ1 PH-PI çalışma pH modülasyon deneyi kullanılmıştır. Ayrıntılı bir protokol aracılığıyla, mikroakışkan aygıt bileşenlerini hazırlamak ve bir araya getirmek, küçük tek katmanlı vezikülleri (SUV'ler) yapmak ( Şekil 2 ), bir aygıt içinde SLB'ler oluşturma ( Şekil 3 ) ve PIP iç…

Discussion

Her bir PIP varyantı, düşük konsantrasyonlarda olsalar da, organel membran 1'in eşsiz bir fiziksel bileşimi ve fonksiyonel özgünlüğünün tesis edilmesine katkıda bulundukları belirli organellerin sitosolik yüzeyi üzerinde bulunur. PIPs en önemli kullanım alanlarından biri, belirli bir hücre içi lokalizasyonu ve / veya aktivasyonunu 6, 7 gerektiren protein sayıda için belirli bir yerleştirme platformu gibidir. H?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

DS ve MSK, kısmen hibe AI053531 (NIAID, NIH) tarafından desteklendi; SS ve PSC hibe N00014-14-1-0792 (ONR) tarafından desteklendi.

Materials

Coverslip
Glass Coverslips: Rectangles Fisher Scientific 12-544B 22 x 40 x 0.16 – 0.19 mm, No. 1 1/2; Borosilicate Glass
7X Cleaning Solution MP Biomedicals 976670 Detergent
PYREX Crystallizing Dish Corning 3140-190 Borosilicate glass dish with a flat bottom; Diameter x Height (190 x 100 mm); Distributor: VWR (89090-700)
Sentry Xpress 2.0 Paragon Industries SC-2 Kiln
Name Company Catalog Number Comments
PDMS
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit Dow Corning  4019862 Polydimethylsiloxane (PDMS); Distributor: Ellsworth Adhesives
PYREX Desiccator VWR 89134-402 Vacuum Rated
Biopsy punch Harris 15110-10 Harris Uni-Core; 1.0 mm diameter; Miltex Biopsy Punch with Plunger (Cat. No. 15110-10) can be used as an alternative
Name Company Catalog Number Comments
Device
Plasma Cleaning System PlasmaEtch PE25-JW 2-stage Direct Drive Oil Vacuum Pump, O2 service (Krytox Charged)
Digital Hot Plate Benchmark H3760-H Purchased through Denville Scientific (Cat. No. 1005640)
Frosted Micro Slides VWR 48312-003 Frosted, Selected, and Precleaned; Made of Swiss Glass; Thickness: 1 mm; Dimensions: 75 x 25 mm; GR 144
Name Company Catalog Number Comments
Mold
AutoCAD Autodesk v.2016 Drafting software for the photomask design
Photomask CAD/Art Services N/A Design with black background and clear features was printed at 20k dpi resolution on a transparent mask (5 x 7 in) by CAD/Art Services
Silicone Wafers University Wafer 1575 Prime Grade, Single Side Polished; 100 mm (4 inch) Diameter; 525 um Thickness
SU-8 50 MicroChem Corp. N/A Negative Tone Photoresist; Penn State Nanofabrication Facility Property
SU-8 Developer MicroChem Corp. N/A Penn State Nanofabrication Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
SUV
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Avanti Polar Lipids 850457C POPC
L-α-phosphatidylinositol-4-phosphate Avanti Polar Lipids 840045X PI4P
L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate  Avanti Polar Lipids 840046X PI(4,5)P2
1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine Avanti Polar Lipids 850757C POPE; Required for the synthesis of oSRB-POPE
Lissamine Rhodamine B Sulfonyl Chloride (mixed isomers) ThermoFisher Scientific L-20 Required for the synthesis of oSRB-POPE
pH Sensitive Fluorescent Lipid Probe (oSRB-POPE) In-house N/A In-house Synthesis (Huang D. et al. 2013)
Glass Scintillation Vial VWR 66022-065 20 mL volume capacity
Aquasonic 250D VWR N/A Ultrasonic Water Bath
Nuclepore Track-Etched Membranes Whatman 110605 Polycarbonate Membrane; Diameter: 25 mm; Pore Size: 0.1 um; Distributor: Sigma-Aldrich
Chloroform VWR CX1054-6 HPLC grade
LIPEX Extruder Transferra Nanosciences T.001 LIPEX 10 mL Thermobarrel Extruder
Viscotek 802 DLS Malvern Instruments N/A Dynamic Light Scattering; Penn State X-Ray Crystallography Facility Property
Name Company Catalog Number Comments
Data Analysis
GraphPad Prism GraphPad Software v.6 Curve-fitting software for data analysis
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Axiovert 200M Epifluorescence Microscope Carl Zeiss Microscopy N/A Microscope
AxioCam MRm Camera Carl Zeiss Microscopy N/A Camera
X-Cite 120 Excelitas Technologies N/A Light Source
Alexa 568 Filter Set Carl Zeiss Microscopy N/A Ex/Em 576/603 nm
AxioVision LE64 v.4.9.1.0 Software Carl Zeiss Microscopy N/A Image Processing Software
Name Company Catalog Number Comments
기타
Tips VWR 10034-132 200 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the protein solution into the microfluidic channel
Tips VWR 53509-070 10 uL pipette tips; Thin and smooth tip for applying the vesicle solution into the microfluidic channel
Orion Star A321 pH meter Thermo Scientific STARA3210 pH meter
Orion micro pH probe Thermo Scientific 8220BNWP micro pH probe
N-(2-Hydroxyethyl)-Piperazine-N'-(2-Ethanesulfonic Acid) VWR VWRB30487 HEPES, Free Acid
Sodium Chloride VWR BDH8014-2.5KGR NaCl
Tubing Allied Wire & Cable TFT-200-24 N Internal Diameter: 0.020-0.026 inches (0.051-0.066 cm); Wall Thickness: 0.010 inches (0.025 cm); Flexible Polytetrafluoroethylene Thin-Wall Tubing; Natural Color
Nitrogen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Oxygen Gas – Industrial Praxair N/A Local Provider
Liquid Nitrogen Praxair N/A Local Provider
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Paolo, G., De Camilli, P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics. Nature. 443 (7112), 651-657 (2006).
  2. Shewan, A., Eastburn, D. J., Mostov, K. Phosphoinositides in cell architecture. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (8), a004796 (2011).
  3. Picas, L., Gaits-Iacovoni, F., Goud, B. The emerging role of phosphoinositide clustering in intracellular trafficking and signal transduction. F1000Res. 5, (2016).
  4. Lystad, A. H., Simonsen, A. Phosphoinositide-binding proteins in autophagy. FEBS Lett. 590 (15), 2454-2468 (2016).
  5. Balla, T. Phosphoinositides: Tiny lipids with giant impact on cell regulation. Physiol Rev. 93, 1019-1137 (2013).
  6. Lemmon, M. A. Membrane recognition by phospholipid-binding domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (2), 99-111 (2008).
  7. Kutateladze, T. G. Translation of the phosphoinositide code by PI effectors. Nat Chem Biol. 6 (7), 507-513 (2010).
  8. Harlan, J. E., Hajduk, P. J., Yoon, H. S., Fesik, S. W. Pleckstrin homology domains bind to phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate. Nature. 371 (6493), 168-170 (1994).
  9. Garcia, P., et al. The pleckstrin homology domain of phospholipase C-delta 1 binds with high affinity to phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate in bilayer membranes. 생화학. 34 (49), 16228-16234 (1995).
  10. Lemmon, M. A., Ferguson, K. M., O’Brien, R., Sigler, P. B., Schlessinger, J. Specific and high-affinity binding of inositol phosphates to an isolated pleckstrin homology domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (23), 10472-10476 (1995).
  11. Flesch, F. M., Yu, J. W., Lemmon, M. A., Burger, K. N. Membrane activity of the phospholipase C-delta1 pleckstrin homology (PH) domain. Biochem J. 389, 435-441 (2005).
  12. Narayan, K., Lemmon, M. A. Determining selectivity of phosphoinositide-binding domains. Methods. 39 (2), 122-133 (2006).
  13. Scott, J. L., Musselman, C. A., Adu-Gyamfi, E., Kutateladze, T. G., Stahelin, R. V. Emerging methodologies to investigate lipid-protein interactions. Integr Biol (Camb). 4 (3), 247-258 (2012).
  14. Dowler, S., Currie, R. A., Downes, C. P., Alessi, D. R. DAPP1: A dual adaptor for phosphotyrosine and 3-phosphoinositides. Biochem J. 342, 7-12 (1999).
  15. He, J., et al. Molecular basis of phosphatidylinositol 4-phosphate and ARF1 GTPase recognition by the FAPP1 pleckstrin homology (PH) domain. J Biol Chem. 286 (21), 18650-18657 (2011).
  16. Ceccarelli, D. F., et al. Non-canonical interaction of phosphoinositides with pleckstrin homology domains of Tiam1 and ArhGAP9. J Biol Chem. 282 (18), 13864-13874 (2007).
  17. Huang, S., Gao, L., Blanchoin, L., Staiger, C. J. Heterodimeric capping protein from Arabidopsis is regulated by phosphatidic acid. Mol Biol Cell. 17 (4), 1946-1958 (2006).
  18. Yu, J. W., et al. Genome-eide analysis of membrane targeting by S. cerevisiae pleckstrin homology domains. Mol Cell. 13 (5), 677-688 (2004).
  19. Jung, H., Robison, A. D., Cremer, P. S. Detecting protein-ligand binding on supported bilayers by local pH modulation. J Am Chem Soc. 131 (3), 1006-1014 (2009).
  20. Huang, D., Zhao, T., Xu, W., Yang, T., Cremer, P. S. Sensing small molecule interactions with lipid membranes by local pH modulation. Anal Chem. 85 (21), 10240-10248 (2013).
  21. Saxena, A., et al. Phosphoinositide binding by the pleckstrin homology domains of Ipl and Tih1. J Biol Chem. 277 (51), 49935-49944 (2002).
  22. Knödler, A., Mayinger, P. Analysis of phosphoinositide-binding proteins using liposomes as an affinity matrix. Biotechniques. 38 (6), 858-862 (2005).
  23. Baumann, M. K., Swann, M. J., Textor, M., Reimhult, E. Pleckstrin homology-phospholipase C-delta1 interaction with phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate containing supported lipid bilayers monitored in situ with dual polarization interferometry. Anal Chem. 83 (16), 6267-6274 (2011).
  24. Saliba, A. E., et al. A quantitative liposome microarray to systematically characterize protein-lipid interactions. Nat Methods. 11 (1), 47-50 (2014).
  25. Arauz, E., Aggarwal, V., Jain, A., Ha, T., Chen, J. Single-molecule analysis of lipid-protein interactions in crude cell lysates. Anal Chem. 88 (8), 4269-4276 (2016).
  26. Best, Q. A., Xu, R., McCarroll, M. E., Wang, L., Dyer, D. J. Design and investigation of a series of rhodamine-based fluorescent probes for optical measurements of pH. Org Lett. 12 (14), 3219-3221 (2010).
  27. Lee, J., Choi, K. H., Yoo, K. Innovative SU-8 lithography techniques and their applications. Micromachines. 6 (1), 1-18 (2014).
  28. Poyton, M. F., Sendecki, A. M., Cong, X., Cremer, P. S. Cu(2+) binds to phosphatidylethanolamine and increases oxidation in lipid membranes. J Am Chem Soc. 138 (5), 1584-1590 (2016).
  29. Karasek, P., Grym, J., Roth, M., Planeta, J., Foret, F. Etching of glass microchips with supercritical water. Lab Chip. 15 (1), 311-318 (2015).
  30. Thomas, M. S., et al. Print-and-peel fabrication for microfluidics: what’s in it for biomedical applications?. Ann Biomed Eng. 38 (1), 21-32 (2010).
  31. Waheed, S., et al. 3D printed microfluidic devices: enablers and barriers. Lab Chip. 16 (11), 1993-2013 (2016).
  32. Axmann, M., Schutz, G. J., Huppa, J. B. Single molecule fluorescence microscopy on planar supported bilayers. J Vis Exp. (105), e53158 (2015).
  33. Barenholz, Y., et al. A simple method for the preparation of homogeneous phospholipid vesicles. 생화학. 16 (12), 2806-2810 (1977).
  34. Castellana, E. T., Cremer, P. S. Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design. Surface Science Reports. 61 (10), 429-444 (2006).
  35. Hamai, C., Yang, T., Kataoka, S., Cremer, P. S., Musser, S. M. Effect of average phospholipid curvature on supported bilayer formation on glass by vesicle fusion. Biophys J. 90 (4), 1241-1248 (2006).
  36. Tero, R. Substrate effects on the formation process, structure and physicochemical properties of supported lipid bilayers. Materials. 5 (12), 2658-2680 (2012).
  37. Ferguson, K. M., Lemmon, M. A., Schlessinger, J., Sigler, P. B. Structure of the high affinity complex of inositol trisphosphate with a phospholipase C pleckstrin homology domain. Cell. 83 (6), 1037-1046 (1995).
  38. Simonsson, L., Hook, F. Formation and diffusivity characterization of supported lipid bilayers with complex lipid compositions. Langmuir. 28 (28), 10528-10533 (2012).
  39. Cong, X., Poyton, M. F., Baxter, A. J., Pullanchery, S., Cremer, P. S. Unquenchable surface potential dramatically enhances Cu(2+) binding to phosphatidylserine lipids. J Am Chem Soc. 137 (24), 7785-7792 (2015).
  40. Robison, A. D., et al. Polyarginine interacts more strongly and cooperatively than polylysine with phospholipid bilayers. J Phys Chem B. 120 (35), 9287-9296 (2016).
  41. Robison, A. D., Huang, D., Jung, H., Cremer, P. S. Fluorescence modulation sensing of positively and negatively charged proteins on lipid bilayers. Biointerphases. 8 (1), 1 (2013).
  42. Tabaei, S. R., et al. Formation of cholesterol-rich supported membranes using solvent-assisted lipid self-assembly. Langmuir. 30 (44), 13345-13352 (2014).
  43. Johnson, S. J., et al. Structure of an adsorbed dimyristoylphosphatidylcholine bilayer measured with specular reflection of neutrons. Biophys J. 59 (2), 289-294 (1991).
  44. Koenig, B. W., et al. Neutron reflectivity and atomic force microscopy studies of a lipid bilayer in water adsorbed to the surface of a silicon single crystal. Langmuir. 12 (5), 1343-1350 (1996).
  45. Tanaka, M., Sackmann, E. Polymer-supported membranes as models of the cell surface. Nature. 437 (7059), 656-663 (2005).
  46. Renner, L., et al. Supported lipid bilayers on spacious and pH-responsive polymer cushions with varied hydrophilicity. J Phys Chem B. 112 (20), 6373-6378 (2008).
  47. Wagner, M. L., Tamm, L. K. Tethered polymer-supported planar lipid bilayers for reconstitution of integral membrane proteins: Silane-polyethyleneglycol-lipid as a cushion and covalent linker. Biophys J. 79 (3), 1400-1414 (2000).
  48. Pace, H., et al. Preserved transmembrane protein mobility in polymer-supported lipid bilayers derived from cell membranes. Anal Chem. 87 (18), 9194-9203 (2015).
  49. Braunger, J. A., Kramer, C., Morick, D., Steinem, C. Solid supported membranes doped with PIP2: Influence of ionic strength and pH on bilayer formation and membrane organization. Langmuir. 29 (46), 14204-14213 (2013).
  50. Paridon, P. A., de Kruijff, B., Ouwerkerk, R., Wirtz, K. W. Polyphosphoinositides undergo charge neutralization in the physiological pH range: A 31P-NMR study. Biochim Biophys Acta. 877 (1), 216-219 (1986).
  51. Liu, C., Huang, D., Yang, T., Cremer, P. S. Monitoring phosphatidic acid formation in intact phosphatidylcholine bilayers upon phospholipase D catalysis. Anal Chem. 86 (3), 1753-1759 (2014).
  52. Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
  53. Hsu, N. Y., et al. Viral reorganization of the secretory pathway generates distinct organelles for RNA replication. Cell. 141 (5), 799-811 (2010).
  54. Del Campo, C. M., et al. Structural basis for PI(4)P-specific membrane recruitment of the Legionella pneumophila effector DrrA/SidM. Structure. 22 (3), 397-408 (2014).
  55. Kolli, S., et al. Structure-function analysis of vaccinia virus H7 protein reveals a novel phosphoinositide binding fold essential for poxvirus replication. J Virol. 89 (4), 2209-2219 (2015).
  56. Cho, N. J., et al. Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate is an HCV NS5A ligand and mediates replication of the viral genome. Gastroenterology. 148 (3), 616-625 (2015).

Tags

Keywords: Protein-phosphoinositide InteractionsLabel-freeMembrane InteractionsPIP-on-a-chip AssayPDMSPhosphatidylcholinePhosphatidylinositol 45-bisphosphatePH-sensitive Fluorescent ProbeLipid VesiclesLabel-free MonitoringBiologically RelevantTherapeutic TargetsMembrane Proteins
check_url/kr/55869?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Shengjuler, D., Sun, S., Cremer, P. S., Cameron, C. E. PIP-on-a-chip: A Label-free Study of Protein-phosphoinositide Interactions. J. Vis. Exp. (125), e55869, doi:10.3791/55869 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image