Studie van eiwit-eiwitinteractie in Autophagy onderzoek
Summary
Gepresenteerd hier zijn twee antilichaam gebaseerde eiwit-eiwit interactie onderzoekstechnieken: immunofluorescentie en immunoprecipitation. Deze technieken zijn geschikt voor de studie van de fysieke interacties tussen eiwitten voor de ontdekking van nieuwe onderdelen van cellulaire signaalroutes en begrip eiwit dynamiek.
Abstract
Eiwit-eiwitinteractie zijn belangrijk voor het begrip cellulaire signalering cascades en herkenbare roman traject onderdelen en eiwit dynamiek. De meerderheid van cellulaire activiteiten vereist fysieke interactie tussen proteïnen. Te analyseren en kaart van deze interacties, werden verschillende experimentele technieken evenals bioinformatica tools ontwikkeld. Autophagy is een mobiele recycling mechanisme waarmee de cellen om te gaan met andere stressoren, met inbegrip van nutriënten ontbering, chemicaliën en hypoxie. Om signalering autophagy-gebeurtenissen beter te begrijpen en te ontdekken van nieuwe factoren die regelen van eiwitcomplexen in autophagy, trad we eiwit-eiwit interactie schermen. Validatie van de resultaten van deze screening vereist het gebruik van immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken. In dit systeem, specifieke autophagy-gerelateerde eiwit-eiwitinteractie die we ontdekt werden getest in Neuro2A (N2A) en HEK293T cellijnen. Details over de technische procedures die zijn uitgelegd in deze gevisualiseerde experiment papier.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, hierin) is een mechanisme van cellulaire spanning die wordt gekenmerkt door de inbeslagneming van bulk cytoplasma, eiwitten en organellen in dubbele membraan blaasjes autophagic blaasjes genoemd. Door de fusie van de buitenste laag van het dubbele membraan, autophagic blaasjes en hun lading zijn geleverd aan lysosomen en daarin1gedegradeerd. Autophagy treedt op basale laag in alle soorten van de cellen en alle organismen, homeostatische functies zoals de aantasting van het eiwit en organel (b.v., mitochondriën) omzet. Onder omstandigheden leiden tot cellulaire stress, zoals honger, autophagy is snel upregulated en maakt de cel energie niveaus en fundamentele metabolisme1,2,3te handhaven.
Ongeveer 30 autophagy genen hebben gekloond uit de gist en hun eiwitproducten bleken een rol te spelen in verschillende stadia van het autophagic proces, inclusief vesikel nucleatie, uitbreiding, blaasje fusion laat endosome/lysosoom en aantasting van de lading 4 , 5. Orthologs van de meerderheid van deze genen zijn geïdentificeerd en studies in verschillende organismen bevestigd behoud van hun cellulaire functies6. Studies in de afgelopen tien jaar is gebleken dat verschillende autophagy-gerelateerde eiwitcomplexen en eiwit-eiwitinteractie bestaan en dat ze autophagy trajecten in een ingewikkelde en gecontroleerde manier regeren. Kruispunten, back-ups en feedback feedforward mechanismen bestaan, en ze laten de cel te coördineren autophagy met andere verwante evenementen (zoals vesiculaire secretie, lysosoom biogenese, sortering en transport van de endosomal7, enz.) In een onbevooroordeelde gist-twee hybride-scherm met behulp van de autophagy proteïne ATG5 als aas, (ATG5 is een belangrijke autophagy eiwitten die betrokken zijn bij het E2-achtige conjugating systeem dat LC3 lipidation in honger bemiddelt geïnduceerde autophagy), hebben wij vastgesteld Receptor geactiveerd C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) als een sterke interactor en een roman autophagy onderdeel8. Nog belangrijker is, is het scherm laat zien dat de ATG5-RACK1-interactie onmisbaar voor autophagy inductie door klassieke autophagy inductoren (d.w.z., honger en mTOR remming was).
Immunofluorescentie gebaseerde methoden worden vaak gebruikt om te controleren van eiwit-eiwitinteractie. Deze technieken zijn voornamelijk gebaseerd op antilichaam en helpen te visualiseren interacties en cellulaire lokalisaties te bevestigen. Bij deze techniek, TL tag geconjugeerde antilichamen die specifiek zijn voor proteïnen van belang zijn in het algemeen gebruikt voor een specifieke kleuring. Elke proteïne kan worden aangeduid met de antilichamen, gekoppeld aan verschillende fluorescente kleurstoffen. Een overlapping in het signaal wanneer afbeeldingen worden samengevoegd met eiwit-specifieke antilichamen, en geeft aan dat de co lokalisatie van eiwitten onder confocale microscopie. De techniek is van toepassing op cellen of zelfs weefsels. Immunofluorescentie technieken geven aanwijzingen over de dynamiek van de interactie, en helpen bij het identificeren van de grootte en de distributie van eiwitcomplexen, terwijl het bijhouden van algemene wijzigingen in cellulaire morfologie onder verschillende omstandigheden9. Immunoprecipitation is een andere veel gebruikte antilichaam gebaseerde techniek die het mogelijk voor de analyse van de wisselwerking maakt tussen gegeven eiwitten10. Met behulp van deze techniek, eiwitten van belang zijn geïsoleerde van cellen of weefsel wordt geëxtraheerd met behulp van specifieke antilichamen, resulterend in de precipitatie van de eiwitten die in een complex of in contact met een proteïne van belang. Co-immunoprecipitation, waar de eiwitten en zijn mede interactor worden gedetecteerd, blijkt niet alleen de interactie tussen de twee eiwitten, maar kan meten de sterkte van interactie onder verschillende omstandigheden11.
Dit protocol beschrijft in detail belangrijke technieken die werden gebruikt om te bevestigen en karakteriseren van ATG5-RACK1 en RACK1-LC3 interactie. De focus ligt op immunofluorescentie en immunoprecipitation technieken, met nadruk van kritische stappen en valkuilen voor autophagy onderzoek, evenals het oplossen van problemen met suggesties.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation en immunofluorescentie technieken zijn cruciaal voor de studie van eiwit-eiwitinteractie. Hoewel deze twee technieken vaak gebruikt worden en gevestigde, verscheidene criteria moeten worden overwogen om te definiëren van de kwaliteit van de experimenten tijdens het gebruik van deze technieken.
Eerste, primaire antilichamen die worden gebruikt in deze tests moet specifiek voor de proteïnen van belang. Om hiervoor te zorgen, shRNA knockdowns of knock-out cellen gebruiken om…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de wetenschappelijke en technologische onderzoek Raad van Turkije (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, de Sabanci Universiteit. SEB en NMK worden ondersteund door een TUBITAK BIDEB 2211 beurs voor Ph.D. studies.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
