Protein-protein etkileşimlerinin Autophagy araştırma çalışma
Summary
Sunulan iki antikor tabanlı protein-protein etkileşimi araştırma tekniği vardır: ayirt ve immunoprecipitation. Bu teknikler proteinlerin hücresel sinyal yollar roman bileşenleri keşfi ve anlayış protein dinamikleri arasında fiziksel etkileşimleri çalışmak için uygundur.
Abstract
Protein-protein etkileşimleri anlayış hücresel sinyal cascades ve tanımlayıcı roman yol bileşenleri ve protein dynamics için önemlidir. Hücresel aktiviteler çoğunluğu proteinler arasındaki fiziksel etkileşim gerektirir. Analiz ve bu etkileşimler eşlemek için Biyoinformatik araçlarını yanı sıra çeşitli deneysel teknikler geliştirilmiştir. Autophagy besin yoksunluğu, kimyasallar ve hipoksi gibi farklı stres ile başa çıkmak hücreleri sağlar mekanizması geri dönüşüm bir cep var. Autophagy ilgili sinyal olayları daha iyi anlamak için ve protein kompleksleri autophagy düzenleyen roman etkenler keşfetmeye, protein-protein etkileşim ekranlar uygulandı. Bu tarama sonuçlar doğrulama ayirt ve immunoprecipitation teknikleri kullanımını gerektirir. Bu sistemde biz keşfetti belirli autophagy kaynaklı protein-protein etkileşimleri Neuro2A içinde test edildi (N2A) ve HEK293T hücre hatları. Kullanılan teknik prosedürler ayrıntılarını bu görüntülenmeyecektir deney yazıda açıklanmıştır.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, burada) toplu sitoplazma, proteinler ve organelleri autophagic veziküller denilen çift cidarlı veziküller içinde tutma ile karakterize bir hücresel stres mekanizmadır. Çift cidarlı dış tabakası füzyonu, autophagic veziküller ve onların kargo organellerin için teslim edilir ve orada1bozulmuş. Tüm hücre tipleri ve tüm organizmalar, homeostatik fonksiyonları protein yıkımı ve organel (örneğin, mitokondri) ciro gibi performans düşük Bazal seviyelerde Autophagy oluşur. Hücresel stres, açlık gibi önde gelen koşullar altında autophagy hızla upregulated ve hücre enerji düzeyleri ve temel metabolizma1,2,3korumak için olanak sağlar.
30 autophagy genler Maya klonlanmış ve protein ürünleri sivilce çekirdekleşme, genişleme, vezikül fusion geç endosome/lysosome ve kargo bozulması autophagic bir işlemi, çeşitli aşamalarında bir rol oynamaya gösterildi 4 , 5. Orthologs bu genlerin çoğunluğunun tespit edilmiştir ve çeşitli organizmalar çalışmalarda doğruladı onların hücresel işlevler6korunması. Çalışmalar son on yılda birkaç protein kompleksleri ve protein-protein etkileşimleri ve onlar karmaşık ve kontrollü bir şekilde autophagy yolları yöneten ilgili autophagy gösterdi. Kesişme noktalarında, yedeklemeler, geri bildirim ve feedforward mekanizmaları var ve onlar hücre autophagy (veziküler salgılanması, lysosome dipnotlar, endosomal sıralama ve taşıma7, vb) gibi ilgili diğer olaylar ile koordine etmek için izin Autophagy protein ATG5 bir yem olarak kullanarak bir tarafsız Maya-iki melez ekran (ATG5 olan bir anahtar autophagy protein açlık LC3 lipidation aracılık eder E2 benzeri conjugating sistemi dahil indüklenen autophagy), biz aktive reseptör belirledik C-kinaz 1 (RACK1; GNB2L1) olarak güçlü bir etkileşen ve roman autophagy bileşen8. Önemlisi, ekran ATG5 RACK1 etkileşim autophagy indüksiyon klasik autophagy indükleyicileri (Yani, açlık ve mTOR inhibisyon) tarafından için vazgeçilmez olduğunu gösterdi.
Ayirt tabanlı yöntemler genellikle protein-protein etkileşimleri izlemek için kullanılır. Bu teknikler antikor ağırlıklı ve etkileşimleri görselleştirmek ve hücresel yerelleştirmeler onaylamak için yardımcı olur. Bu teknikte, floresan tag özgü konjuge antikor protein ilgi genellikle belirli boyama için kullanılır. Her protein ile birleştiğinde için farklı floresan boyalar antikor olarak etiketlenmiş olabilir. Protein özel antikorlar kullanarak, bir çakışma görüntüleri birleştirildiğinde sinyal içinde eş yerelleştirme confocal mikroskobu altında proteinlerin gösterir. Hücreleri veya hatta dokular için uygun bir tekniktir. Ayirt teknikleri etkileşim dinamikleri hakkında ipuçları sağlayabilir ve hücresel Morfoloji farklı koşullar9altında genel değişiklikleri izlerken protein kompleksleri, dağılımı ve boyutu belirlemek. Immunoprecipitation tekniktir etkileşimleri analiz için izin veren başka bir sık kullanılan antikor tabanlı arasında proteinler10göz önüne alındığında. Bu tekniği kullanarak, ilgi hücreleri izole proteinlerdir veya karmaşık veya ilgi bir protein ile temas halinde olan proteinlerin yağış kaynaklanan özel antikorlar kullanarak doku ayıklar. Co-immunoprecipitation, nerede protein ve onun ortak etkileşen tespit edilir, sadece iki protein arasındaki etkileşimi ortaya çıkarır, ama farklı koşullar11altında etkileşimin gücünü ölçebilirsiniz.
Bu iletişim kuralı onaylayın ve ATG5-RACK1 ve RACK1-LC3 etkileşim karakterize için kullanılan ayrıntı anahtar teknikleri açıklar. Kritik adımlar ve tuzaklar autophagy araştırma gibi öneriler sorun giderme için vurgu ile ayirt ve immunoprecipitation teknikleri üzerine odaklanmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation ve ayirt teknikleri protein-protein etkileşimleri çalışma için önemlidir. Bu iki teknikleri yaygın olarak kullanılan ve iyi kurulmuş olmakla birlikte, bu teknikleri kullanırken deneyler kalitesini tanımlamak için çeşitli kriterler dikkate alınmalıdır.
Bu testlerde kullanılan ilk, birincil antikorlar faiz proteinler için kesin gerekir. Bunu sağlamak için shRNA nakavtlar veya nakavt hücreleri antikor söz konusu özgüllük sınamak için kullanın. Ayr?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser bilimsel ve Teknolojik Araştırma Konseyi, Türkiye (TÜBİTAK) 1001 Grant 107T153 tarafından Sabancı Üniversitesi desteklenmiştir. SEB ve NMK TÜBİTAK BIDEB 2211 burs doktora çalışmaları için destekler.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
