Undersøgelse af Protein-protein interaktioner i Autophagy forskning
Summary
Præsenteres her er to antistof-baseret protein-protein interaktion forskningsteknikker: immunofluorescens og immunoprecipitation. Disse teknikker er egnet til at studere fysiske samspil mellem proteiner til opdagelsen af nye komponenter af cellulær signalering veje og forståelse protein dynamics.
Abstract
Protein-protein interaktioner er vigtige for forståelsen cellulær signalering kaskader og identificere roman pathway komponenter og protein dynamics. Fleste af cellulære aktiviteter kræver fysisk interaktion mellem proteiner. For at analysere og kortlægge disse interaktioner, blev forskellige eksperimentelle teknikker såvel som bioinformatik værktøjer udviklet. Autophagy er en cellulær genanvendelse mekanisme, der tillader cellerne til at håndtere forskellige stressfaktorer, herunder næringsstof afsavn, kemikalier og hypoxi. For bedre at forstå autophagy-relaterede signalering begivenheder og til at opdage nye faktorer, der regulerer proteinkomplekser i autophagy udført vi protein-protein interaktion skærme. Validering af disse screening resultater kræver brug af immunofluorescens og immunoprecipitation teknikker. I dette system, specifikke autophagy-relaterede protein-protein interaktioner, der opdagede vi blev testet i Neuro2A (N2A) og HEK293T cellelinjer. Nærmere oplysninger om de anvendte tekniske procedurer er forklaret i denne visualiseret eksperiment papir.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, heri) er et cellulært stress mekanisme, der er karakteriseret ved binding af bulk cytoplasma, proteiner og organeller i dobbelt membran vesikler kaldet autophagic vesikler. Gennem fusion af det ydre lag af den dobbelt membran, autophagic blærer og deres last er leveret til lysosomer og forringet deri1. Autophagy opstår på lav basal niveauer i alle celletyper og i alle organismer, udfører homeostatiske funktioner såsom protein nedbrydning og organelle (fx, mitokondrierne) omsætning. Under vilkår, som fører til cellulært stress, såsom sult, autophagy er hurtigt upregulated og tillader cellen at opretholde energi niveauer og basale stofskifte1,2,3.
Omkring 30 autophagy gener er blevet klonet fra gæren og deres proteinprodukter blev vist sig at spille en rolle i forskellige stadier af den autophagic proces, herunder vesikel Nukleering, ekspansion, vesikel fusion til sent endosome/lysosomet og last forringelsen 4 , 5. Orthologs af fleste af disse gener er blevet identificeret og undersøgelser i forskellige organismer bekræftet bevarelse af deres cellulære funktioner6. Undersøgelser i det sidste årti viste, at flere autophagy-relaterede proteinkomplekser og protein-protein interaktioner findes, og at de regulerer autophagy veje i en indviklet og kontrolleret måde. Vejkryds, sikkerhedskopier, feedback og feedforward mekanismer eksisterer, og de tillader cellen at koordinere autophagy med andre relaterede begivenheder (såsom vesikulære sekretion, lysosomet Biogenese, endosomal sortering og transport7, osv.) I en fordomsfri gær-to hybrid skærmen ved hjælp af autophagy proteinet ATG5 som en agn, (ATG5 er en vigtig autophagy protein involveret i E2-lignende conjugating-systemet, der medierer LC3 lipidation i sult induceret autophagy), vi har identificeret Receptor aktiveres C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) som en stærk dataflowdiagrammer og en roman autophagy komponent8. Vigtigere, viste skærmen, at ATG5-RACK1 interaktion var uundværlig for autophagy induktion af klassisk autophagy induktorer (dvs., sult og mTOR hæmning).
Immunofluorescens-baserede metoder er almindeligt anvendt til at overvåge protein-protein interaktioner. Disse teknikker er hovedsagelig baseret på antistoffer, og hjælp til at visualisere interaktioner og bekræfte cellulære lokaliseringer. I denne teknik, fluorescerende tag konjugerede antistoffer, der er specifikke for proteiner af interesse er generelt bruges til specifik farvning. Hver protein kan være mærket med antistoffer koblet til forskellige fluorescerende farvestoffer. Ved hjælp af protein-specifikke antistoffer, angiver en overlapning i signalet når billeder flettes Co lokalisering af proteiner under Konfokal mikroskopi. Teknikken er gældende til celler eller væv, selv. Immunfluorescens teknikker give et fingerpeg om interaktion dynamics, og hjælpe med at identificere størrelsen og fordelingen af proteinkomplekser, mens tracking generelle ændringer i cellulære morfologi under forskellige betingelser9. Immunoprecipitation er en anden almindeligt anvendte antistof-baseret teknik, der giver mulighed for analyse af samspillet mellem givet proteiner10. Brug af denne teknik, proteiner af interesse er isoleret fra celler eller væv ekstrakter ved hjælp af specifikke antistoffer, hvilket resulterer i udfældning af proteiner, der er i en kompleks eller i kontakt med et protein af interesse. Co-immunoprecipitation, hvor proteinet og dets Co dataflowdiagrammer opdages, afslører ikke kun interaktion mellem de to proteiner, men kan måle styrken af interaktion under forskellige omstændigheder11.
Denne protokol beskriver i detaljer vigtigste teknikker, der blev brugt til at bekræfte og karakterisere ATG5-RACK1 og RACK1-LC3 interaktion. Fokus er på immunofluorescens og immunoprecipitation teknikker, med vægt på kritiske faser og faldgruber for autophagy forskning, samt fejlfinding forslag.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation og immunfluorescens teknik er af afgørende betydning for studiet af protein-protein interaktioner. Selv om disse to teknikker er udbredte og veletablerede, flere kriterier bør overvejes at definere kvaliteten af eksperimenter, mens du bruger disse teknikker.
Første, primære antistoffer, der er brugt i disse test skal være specifik for proteiner af interesse. For at sikre dette, skal du bruge shRNA knockdowns eller knockout celler til at teste specificiteten af det påg…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af videnskabelige og teknologiske forskning Rådet af Tyrkiet (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Sabanci Universitet. SEB og NMK understøttes af en TUBITAK BIDEB 2211 stipendium for Ph.D. studier.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
