Studiet av Protein-protein interaksjoner i Autophagy forskning
Summary
Presentert her er to antistoff-basert protein-protein samhandling forskning teknikker: immunofluorescence og immunoprecipitation. Disse teknikkene er egnet for å studere fysiske interaksjonene mellom proteiner for oppdagelsen av romanen komponenter i mobilnettet signalveier og forståelse protein dynamics.
Abstract
Protein-protein interaksjoner er viktig for forståelse mobilnettet signalnettverk cascades og identifisere roman veien komponenter og protein dynamics. Flertallet av mobilnettet aktiviteter krever fysisk interaksjon mellom proteiner. Å analysere og kartlegge disse interaksjoner, ble ulike eksprementelle teknikker samt Bioinformatikk verktøy utviklet. Autophagy er en mobiltelefon resirkulering som gjør at cellene til å takle ulike stressorer, inkludert næringsstoffer deprivasjon, kjemikalier og hypoksi. For å bedre forstå autophagy-relaterte signalnettverk hendelser og oppdage romanen faktorer som regulerer protein kompleks i autophagy, utført vi protein-protein samhandling skjermer. Validering av disse screening resultater krever bruk av immunofluorescence og immunoprecipitation teknikker. I dette systemet, bestemt autophagy-relaterte protein-protein interaksjoner som vi oppdaget ble testet i Neuro2A (N2A) og HEK293T linjer. Detaljer av teknisk prosedyrer brukes forklares i notatet visualisert eksperiment.
Introduction
Macroautophagy (autophagy, her) er en mobilnettet stress mekanisme som er preget av lagring av bulk cytoplasma, proteiner og organelles i dobbel membran blemmer kalt autophagic blemmer. Gjennom fusjon av det ytterste laget av dobbel membranen, autophagic blemmer og frakten leveres til lysosomer og degradert der1. Autophagy skjer på lave basale nivåer i alle celletyper og alle organismer, utfører homøostatisk funksjoner som protein fornedrelse og organelle (f.eks, mitokondrier) omsetning. Under forhold fører til mobilnettet stress, som sult, autophagy er upregulated og lar cellen å opprettholde energi og grunnleggende stoffskifte1,2,3.
Rundt 30 autophagy gener ha blitt Klon fra gjær og deres protein produkter ble vist å spille en rolle i ulike stadier av autophagic prosessen, inkludert vesicle nucleation, utvidelse, vesicle fusion slutten endosome/lysosome, og Last degradering 4 , 5. Orthologs av fleste av disse genene er identifisert og studier i ulike organismer bekreftet bevaring av deres cellular funksjonene6. Studier i det siste tiåret viste at flere autophagy-relaterte proteiner komplekser og protein-protein interaksjoner finnes og at de styrer autophagy veier i en intrikate og kontrollert måte. Kryss, backup, tilbakemeldinger og feedforward mekanismer finnes, og de tillater cellen å koordinere autophagy med andre relaterte hendelser (for eksempel vesicula sekresjon, lysosome biogenesis, endosomal sortering og transport7, etc.) I en upartisk gjær-to hybrid skjermen med autophagy protein ATG5 som agn, (ATG5 er viktige autophagy protein er involvert i E2-lignende conjugating systemet som formidler LC3 lipidation i sult indusert autophagy), har vi identifisert reseptor aktivert C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) som en sterk interactor og romanen autophagy komponent8. Viktigere, viste skjermen at ATG5-RACK1 samspillet var uunnværlig for autophagy induksjon av klassisk autophagy indusere (dvs., sult og mTOR hemming).
Immunofluorescence-baserte metoder brukes ofte til å overvåke protein-protein interaksjoner. Disse teknikkene er hovedsakelig antistoff-basert, og hjelpe å visualisere interaksjoner og bekrefte mobilnettet steder. I denne teknikken, lysstoffrør tag konjugert antistoffer som gjelder proteiner rundt brukes vanligvis for spesifikk farging. Hver protein kan merkes med antistoffer koblet til forskjellige fluorescerende fargestoffer. Overlapp i signalet når bildene er slått sammen bruker protein-spesifikke antistoffer, og angir den co lokaliseringen av proteiner under AC confocal mikroskopi. Teknikken gjelder eller selv vev. Immunofluorescence teknikker gir hint om samhandling dynamics, og å identifisere størrelse og distribusjon av protein komplekser, mens sporing generelle endringer i mobilnettet morfologi under ulike forhold9. Immunoprecipitation er en annen brukte antistoff pustebasert teknikk som lar for analyse av interaksjoner mellom gitt proteiner10. Bruker denne teknikken, proteiner av interesse er isolert fra celler eller vev trekker ut bruker spesifikke antistoffer, resulterer i nedbør av proteiner som er i et kompleks eller i kontakt med et protein av interesse. Co-immunoprecipitation, der protein og dens co interactor oppdages, avslører ikke bare samspillet mellom de to proteinene, men kan måle dens styrke av interaksjon under forskjellige forhold11.
Denne protokollen beskriver i detalj nøkkel teknikker som brukes for å bekrefte og karakterisere ATG5-RACK1 og RACK1-LC3 interaksjon. Fokus er på immunofluorescence og immunoprecipitation teknikker, med vekt på avgjørende skritt og fallgruver for autophagy research, i tillegg til forslagene til feilsøking.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunoprecipitation og immunofluorescence er avgjørende for studiet av protein-protein interaksjoner. Selv om disse to teknikker brukes ofte og godt etablerte flere kriterier bør vurderes å definere kvaliteten på eksperimenter mens du bruker disse teknikkene.
Første, primære antistoffer som brukes i disse testene bør være bestemt proteiner av interesse. For å sikre dette, kan du bruke shRNA bokseren eller knockout celler for å teste spesifisitet av antistoffer i spørsmålet. I tille…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av vitenskapelige og teknologiske Research Council av Tyrkia (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, Sabanci universitetet. SEB og NMK støttes av TUBITAK BIDEB 2211 stipend for doktorgrad studier.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
- Oral, O., Akkoc, Y., Bayraktar, O., Gozuacik, D. Physiological and pathological significance of the molecular cross-talk between autophagy and apoptosis. Histol Histopathol. 31, 479-498 (2016).
- Korkmaz, G., Tekirdag, K. A., Ozturk, D. G., Kosar, A., Sezerman, O. U., Gozuacik, D. MIR376A is a regulator of starvation-induced autophagy. PLoS One. 8, e82556 (2013).
- Itah, Z., et al. Hydrodynamic cavitation kills prostate cells and ablates benign prostatic hyperplasia tissue. Exp Biol Med (Maywood). 238, 1242-1250 (2013).
- Gozuacik, D., Kimchi, A. Autophagy as a cell death and tumor suppressor mechanism). Oncogene. 23, 2891-2906 (2004).
- Erzurumlu, Y., Kose, F. A., Gozen, O., Gozuacik, D., Toth, E. A., Ballar, P. A unique IBMPFD-related P97/VCP mutation with differential binding pattern and subcellular localization. Int J Biochem Cell Biol. 45, 773-782 (2013).
- Kuzuoglu-Ozturk, D., et al. Autophagy-related gene, TdAtg8, in wild emmer wheat plays a role in drought and osmotic stress response. Planta. 236, 1081-1092 (2012).
- Longatti, A., Tooze, S. A. Vesicular trafficking and autophagosome formation. Cell Death Differ. 16, 956-965 (2009).
- Erbil, S., et al. RACK1 Is an Interaction Partner of ATG5 and a Novel Regulator of Autophagy. J Biol Chem. 291, 16753-16765 (2016).
- Gozuacik, D., Yagci-Acar, H. F., Akkoc, Y., Kosar, A., Dogan-Ekici, A. I., Ekici, S. Anticancer use of nanoparticles as nucleic acid carriers. J Biomed Nanotechnol. 10, 1751-1783 (2014).
- Phizicky, E. M., Fields, S. Protein-protein interactions: methods for detection and analysis. Microbiol Rev. 59, 94-123 (1995).
- Uetz, P., et al. A comprehensive analysis of protein-protein interactions in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 403, 623-627 (2000).
