Étude des Interactions protéine-protéine dans la recherche de l’autophagie
Summary
Présentées ici sont deux techniques de recherche d’interaction protéine-protéine de base d’anticorps : immunofluorescence et immunoprécipitation. Ces techniques ne conviennent pas pour l’étude des interactions physiques entre les protéines pour la découverte de nouvelles composantes des voies de signalisation cellulaires et pour comprendre la dynamique de protéine.
Abstract
Interactions protéines-protéines sont importantes pour les cascades de signalisation cellulaire compréhension et identification des composants de voie nouvelle et dynamique des protéines. La majorité des activités cellulaires nécessite des interactions physiques entre les protéines. Pour analyser et cartographier ces interactions, les différentes techniques expérimentales ainsi que des outils bioinformatiques ont été développés. Autophagie est un téléphone cellulaire, mécanisme qui permet aux cellules faire face aux différents stress, y compris l’hypoxie, produits chimiques et la privation nutritive de recyclage. Afin de mieux comprendre les événements de signalisation liés à autophagie et de découvrir de nouveaux facteurs régulateurs complexes protéiques dans autophagie, nous avons réalisé des écrans d’interaction protéine-protéine. Validation de ces résultats de dépistage nécessite l’utilisation de l’immunofluorescence et techniques de l’immunoprécipitation. Dans ce système, les interactions protéine-protéine autophagie spécifique que nous avons découvert ont été testées en Neuro2A (N2A) et des lignées de cellules HEK293T. Détails des procédures techniques utilisées sont expliquées dans le présent document expérience visualisées.
Introduction
Macroautophagy (autophagie, ci-après) est un mécanisme de stress cellulaire qui se caractérise par la séquestration du cytoplasme en vrac, les protéines et les organelles dans les vésicules de membrane double appelés autophagiques vésicules. Par fusion de la couche externe de la membrane double, vésicules autophagiques et leurs cargaisons sont envoyées vers les lysosomes et dégradent y1. Autophagie se produit à faible taux de base dans tous les types de cellules et dans tous les organismes exerçant des fonctions homéostatiques tels que la dégradation des protéines et organelle (p. ex., mitochondries) chiffre d’affaires. Dans des conditions menant à des stress cellulaire, comme la famine, autophagie est rapidement augmentée et permet à la cellule de maintenir des niveaux d’énergie et le métabolisme de base1,2,3.
Environ 30 autophagie gènes ont été clonés à partir de la levure et de leurs produits protéiques ont été montrés à jouer un rôle dans les différentes étapes du processus autophagique, y compris la nucléation de la vésicule, l’expansion, la fusion des vésicules de l’endosome tardif/lysosome et la dégradation de la cargaison 4 , 5. orthologues de la majorité de ces gènes ont été identifiés et études dans divers organismes ont confirmé la préservation de leurs fonctions cellulaires6. Études dans la dernière décennie a montré que plusieurs autophagie liés complexes protéiques et interactions protéine-protéine existent et qu’elles régissent les voies autophagie de manière complexe et contrôlée. Intersections, sauvegardes, vos commentaires et feedforward mécanismes existent, et ils permettent à la cellule de coordonner l’autophagie avec d’autres événements connexes (tels que la sécrétion vésiculaire, biogenèse lysosome, endosomale tri et transport7, etc.) Dans un écran impartiale levure-double hybride utilisant la protéine de l’autophagie ATG5 comme un appât, (ATG5 est une protéine de l’autophagie clés impliquées dans le système de conjugaison E2-like qui médie LC3 lipidation en famine induite par autophagie), nous avons identifié le récepteur activé C-Kinase 1 (racks 1 ; GNB2L1) comme un interacteur forte et une composante d’autophagie roman8. Ce qui est important, l’écran a montré que l’interaction ATG5-racks 1 était indispensable pour l’induction d’autophagie par inducteurs autophagie classique (c’est-à-dire, la famine et le mTOR inhibition).
Méthodes axées sur l’immunofluorescence sont utilisées pour surveiller les interactions protéine-protéine. Ces techniques sont principalement axés sur les anticorps et aident à visualiser les interactions et de confirmer la localisation cellulaire. Dans cette technique, fluorescentes tag conjugués anticorps spécifiques aux protéines d’intérêt sont généralement utilisés pour la coloration spécifique. Chaque protéine peut-être être étiqueté avec des anticorps couplés à des fluorochromes différents. À l’aide d’anticorps spécifiques de la protéine, une superposition du signal lorsque des images sont fusionnés indique la co-localisation des protéines sous microscopie confocale. Cette technique est applicable à des cellules ou tissus même. Techniques d’immunofluorescence fournissent des indices sur la dynamique de l’interaction et aident à identifier la taille et la distribution des complexes de protéines, tout en poursuivant l’évolution générale de la morphologie cellulaire sous différentes conditions9. L’immunoprécipitation est une autre technique souvent utilisée axée sur les anticorps qui permet l’analyse des interactions entre données protéines10. En utilisant cette technique, les protéines d’intérêt sont isolés des cellules ou tissus extraits à l’aide d’anticorps spécifiques, ce qui entraîne la précipitation des protéines qui sont dans un complexe ou en contact avec une protéine d’intérêt. Co-Immunoprécipitation, où la protéine et son co interacteur sont détectés, révèle non seulement l’interaction entre deux protéines, mais permet de mesurer sa force d’interaction sous différentes circonstances11.
Ce protocole décrit dans les techniques de clés de détail qui ont servi à confirmer et à caractériser les interactions ATG5-racks 1 et racks 1-LC3. L’accent est mis sur les techniques d’immunofluorescence et immunoprécipitation, avec l’accent des étapes critiques et des pièges pour la recherche de l’autophagie, mais aussi suggestions de dépannage.
Protocol
Representative Results
Discussion
Techniques d’immunoprécipitation et immunofluorescence sont essentiels pour l’étude des interactions protéine-protéine. Bien que ces deux techniques sont couramment utilisés et bien établie, plusieurs critères devraient être considérés pour définir la qualité des expériences tout en utilisant ces techniques.
Tout d’abord, primaires des anticorps qui sont utilisées pour ces épreuves doivent être spécifiques aux protéines d’intérêt. Pour ce faire, utilisez shARN passe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par la recherche scientifique et technologique Conseil de Turquie (TUBITAK) 1001 Grant 107T153, l’Université Sabanci. SEB et NMK sont pris en charge par une bourse TUBITAK BIDEB 2211 pour des études de doctorat.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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