Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen in der Autophagie-Forschung
Summary
Präsentiert hier sind zwei Antikörper-basierten Proteinprotein Interaktion Forschungstechniken: Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation. Diese Techniken eignen sich für das Studium der physikalischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen für die Entdeckung der neuartige Komponenten der zelluläre Signalwege und Proteindynamik Verständnis.
Abstract
Protein-Protein-Interaktionen sind wichtig für Verständnis zellulärer Signalisierung Kaskaden und Identifizierung neuer Weg Komponenten und Proteindynamik. Die Mehrheit der zellulären Aktivitäten erfordern physikalische Wechselwirkungen zwischen Proteinen. Um zu analysieren und ordnen Sie diese Interaktionen, wurden verschiedene experimentelle Techniken sowie Bioinformatik-Werkzeuge entwickelt. Autophagie ist ein Handy recycling-Mechanismus, der die Zellen mit verschiedenen Stressoren, wie Nährstoff Entbehrung, Chemikalien und Hypoxie zu bewältigen. Um besser zu verstehen, Signalisierung Autophagie-Veranstaltungen und neuartige Faktoren zu entdecken, die Proteinkomplexe Autophagie regulieren, führten wir durch Protein-Protein Interaktion Bildschirme. Überprüfung dieser Screening-Ergebnisse erfordert den Einsatz von Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation Techniken. In diesem System wurden spezifische Autophagie-related Protein-Protein-Interaktionen, die wir entdeckt in Neuro2A getestet (N2A) und HEK293T-Zell-Linien. Details der verwendeten technischen Verfahren werden in diesem Papier visualisiertes Experiment erklärt.
Introduction
Macroautophagy (Autophagie, hierin) ist ein zellulären Stress-Mechanismus, der durch die Sequestrierung von Schüttgut Zytoplasma, Proteinen und Organellen in Doppelmembran Vesikel genannt selbstverdauende Vesikel auszeichnet. Durch Verschmelzung der äußeren Schicht der doppelten Membran selbstverdauende Vesikel und ihre Ladung an Lysosomen geliefert und darin1abgebaut. Autophagie tritt auf einem niedrigen basalen Niveau in allen Zelltypen und in allen Organismen, homöostatischen Funktionen wie Protein Degradation und Organelle (z.B. Mitochondrien) Umsatz. Unter Bedingungen, die auf zellulären Stress, wie Hunger Autophagie ist schnell hochreguliert und ermöglicht es die Zelle, Energie und Grundumsatz1,2,3zu erhalten.
Rund 30 Autophagie Gene haben von der Hefe geklont worden und ihre Protein-Produkte wurden gezeigt, um eine Rolle in verschiedenen Stadien des selbstverdauende Prozesses, einschließlich der Vesikel Keimbildung, Ausbau, Vesikel Fusion zu späten Endosom/Lysosomen und Fracht Abbau 4 , 5. Orthologe der Mehrheit dieser Gene wurden identifiziert und Studien in verschiedenen Organismen bestätigt Erhalt der ihre Zellfunktionen6. Studien in den letzten zehn Jahren hat gezeigt, dass mehrere Autophagie-bezogene Proteinkomplexe und Protein-Protein-Wechselwirkungen vorhanden sind und dass sie Autophagie Wege in eine komplizierte und kontrolliert zu bestimmen. Kreuzungen, Sicherungen, Feedback und Feedforward-Mechanismen existieren, und sie ermöglichen der Zelle Autophagie mit anderen Ereignissen (z. B. vesikuläre Sekretion, Lysosomen Biogenese, Endosomal Sortierung und Transport7, etc.) zu koordinieren In eine unvoreingenommene Hefe-zwei-Hybrid-Bildschirm mit der Autophagie Protein ATG5 als Köder (ATG5 ist ein wichtiger Autophagie Protein beteiligt das E2-artigen conjugating System, das LC3 Lipidation verhungern vermittelt induzierte Autophagie), wir haben ausgemacht, Rezeptor aktiviert C-Kinase 1 (RACK1; GNB2L1) als eine starke Interaktor und eine neuartige Autophagie Komponente8. Wichtig ist, zeigte der Bildschirm, dass die ATG5-RACK1 Interaktion unverzichtbar für Autophagie Induktion durch klassische Autophagie Induktoren (d.h., Hunger und mTOR-Inhibition).
Immunfluoreszenz-basierte Methoden werden häufig verwendet, um Protein-Protein-Wechselwirkungen zu überwachen. Diese Techniken basieren hauptsächlich auf Antikörper und helfen, zu visualisieren Interaktionen und zelluläre Lokalisierungen zu bestätigen. Bei dieser Technik markieren fluoreszierende konjugierten Antikörper, die speziell für interessierender Proteine werden im Allgemeinen verwendet für spezifische Färbung. Jedes Protein kann mit Antikörpern gekoppelt mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden. Mit Protein-spezifischen Antikörpern, zeigt eine Überlappung des Signals beim Zusammenführen von Bildern die Co Lokalisierung der Proteine unter konfokalen Mikroskopie. Das Verfahren ist anwendbar auf Zellen oder sogar Gewebe. Immunfluoreszenz-Techniken Aufschlüsse über Interaktion Dynamik und helfen, die Größe und Verteilung der Proteinkomplexe, während allgemeine Veränderungen im zellulären Morphologie unter verschiedenen Bedingungen9tracking zu identifizieren. Immunopräzipitation ist eine weitere häufig verwendete Antikörper-basierte Technik, die ermöglicht eine Analyse der Wechselwirkungen zwischen Proteinen10gegeben. Mit dieser Technik interessierender Proteine sind isoliert von Zellen oder Gewebe extrahiert mit spezifischen Antikörpern, wodurch die Fällung von Proteinen, die in einer Anlage oder in Kontakt mit einem Protein des Interesses sind. Co-Immunopräzipitation, wo das Protein und seine Co Interaktor erkannt werden, zeigt nicht nur die Interaktion zwischen den beiden Proteinen, aber seine Stärke der Interaktion unter verschiedenen Umständen11messen kann.
Dieses Protokoll beschreibt im Detail wichtige Techniken, die verwendet wurden, um zu bestätigen und ATG5-RACK1 und RACK1 LC3 Interaktion zu charakterisieren. Der Schwerpunkt liegt auf Immunfluoreszenz und Immunopräzipitation Techniken, mit Betonung der kritischen Schritte und Fallstricke für Autophagie Forschung, sowie die Vorschläge zur Fehlerbehebung.
Protocol
Representative Results
Discussion
Immunopräzipitation und Immunfluoreszenz-Techniken sind entscheidend für die Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen. Obwohl diese beiden Techniken weit verbreitet sind und gut etablierte, mehrere Kriterien berücksichtigt werden, die Qualität der Experimente zu definieren, bei der Verwendung dieser Techniken.
Erste, primäre Antikörper, die in diesen Tests verwendet werden sollte für die interessierenden Proteine spezifisch sein. Um dies zu gewährleisten, verwenden Sie ShRNA N…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch wissenschaftliche und technologische Forschung Rat der Türkei (TÜBITAK) 1001 Grant 107T153, der Sabanci-Universität unterstützt. SEB und NMK werden durch ein TUBITAK BIDEB 2211-Stipendium für Promotion unterstützt.
Materials
| Trypsin EDTA Solution A | Biological Industries | BI03-050-1A | |
| PBS | GE Healthcare | SH-30256.01 | |
| DMEM (high glucose) | Sigma | 5671 | |
| DMEM (low glucose) | Sigma | 5546 | |
| Trypan Blue | Sigma | T8154 | |
| Hemocytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| coverslides | Jena Bioscience | CSL-103 | |
| slides | Isolab | I.075.02.005 | |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | |
| Torin | Tocris | 4247 | |
| DMSO | Sigma | VWRSAD2650 | |
| EBSS | Biological Industries | BI02-010-1A | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma | 15812-7 | |
| BSA | Sigma | A4503 | |
| Saponin | Sigma | 84510 | |
| LC3 Antibody | Sigma | L7543 | |
| Anti-Rabbit IgG Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A11011 | |
| RACK1 Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-17754 | |
| Anti-Mouse IgG Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A11001 | |
| NP-40 | Applichem | A16694.0250 | |
| Sodium Chloride | Applichem | A9242.5000 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | 30970 | |
| Sodium dodecyl sulphate (SDS) | Biochemika | A2572 | |
| Trizma Base | Sigma | T1503 | |
| Triton-X | Applichem | 4975 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma | 450243 | |
| ATG5 Antibody | Sigma | A0856 | |
| Glycerol | Applichem | A4453 | |
| β-Mercaptoethanol | Applichem | A1108.0250 | |
| Bromophenol blue | Applichem | A3640.0005 | |
| Non-Fat milk | Applichem | A0830 | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Sodium Azide | Riedel de Haen | 13412 | |
| Phenol red | Sigma | 114537-5G | |
| anti-rabbit IgG , HRP conjugated | Jackson Immuno. | 1110305144 | |
| Luminol | Fluka | 9253 | |
| Coumeric Acid | Sigma | C9008 | |
| Hydrogen Peroxide | Merck | K35522500604 | |
| anti mouse IgG, HRP conjugated | Jackson Immuno. | 115035003 | |
| β-Actin Antibody | Sigma | A5441 | |
| Normal rabbit serum | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | |
| Rapamycin | Sigma | R0395 | |
| Protein A-Agarose Beads | Santa Cruz Biotechnology | sc-2001 | |
| fetal bovine serum | Biowest | S1810-500 | |
| penicillin/streptomycin solution | Biological Industries | 03-031-1B | |
| L-glutamine | Biological Industries | BI03-020-1B | |
| Bradford Solution | Sigma | 6916 | |
| Nitocellulose membrane | GE Healthcare | A10083108 | |
| X-ray Films | Fujifilm | 47410 19289 | |
| Protease inhibitor | Sigma | P8340 |
References
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