Mozaïek kloon analyse in Drosophila imaginal disc epithelia is een krachtig model systeem om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Hier beschrijven we een protocol om tumoren te induceren in Drosophila- vleugel-imaginale schijven met behulp van het GAL4-UAS-systeem, en introduceert een diagnose-methode om de tumorfenotypen te classificeren.
In de vroege stadia van kanker vertoont getransformeerde mutante cellen cytologische abnormaliteiten, beginnen ongecontroleerde overgroei en weefselorganisatie progressief verstoren. Drosophila melanogaster is ontstaan als een populair experimenteel model systeem in kankerbiologie om de genetische en cellulaire mechanismen van tumorigenese te bestuderen. Met name maken genetische hulpmiddelen voor Drosophila imaginale schijven (ontwikkelende epithelia in larven) het mogelijk om getransformeerde pro-tumorcellen in een normaal epitheliaal weefsel te creëren, een situatie die vergelijkbaar is met de initiële stadia van menselijke kanker. Een recente studie van tumorigenese in Drosophila vleugel-imaginale schijven heeft echter aangetoond dat tumorinitiatie afhankelijk is van de weefsel-intrinsieke cytoarchitectuur en de lokale micro-omgeving, wat suggereert dat het belangrijk is om de regio-specifieke vatbaarheid voor tumorigenische stimuli te overwegen bij het evalueren van tumorfenotypes in imaginal discs. Om fenotypische analyse van tumorprogressie te vergemakkelijkenOp imaginale schijven beschrijven we hier een protocol voor genetische experimenten die het GAL4-UAS-systeem gebruiken om neoplastische tumoren in vleugel-imaginale schijven te induceren. We introduceren verder een diagnose methode om de fenotypen van klonale laesies die in imaginale epithelia zijn geïnduceerd te classificeren, aangezien een duidelijke classificatie methode om verschillende stadia van tumorprogressie te discrimineren (zoals hyperplasie, dysplasie of neoplasie) niet eerder is beschreven. Deze methoden kunnen in grote mate van toepassing zijn op de klonale analyse van tumorfenotypes in verschillende organen in Drosophila .
Epitheliale weefsels zijn hoog georganiseerde systemen die het opmerkelijke homeostatische vermogen hebben om hun organisatie te behouden door de ontwikkeling en de omzet van cellen. Dit robuuste zelforganiserende systeem wordt echter progressief verstoord tijdens de tumorontwikkeling. Bij het begin van de tumorontwikkeling ontstaan individuele mutante cellen die voortkomen uit oncogene activatie of tumor-suppressor gen inactivatie binnen een epitheliale laag. Wanneer deze getransformeerde "pro-tumorcel" een onderdrukkende omgeving ontwricht, epitheliale organisatie verstoord en ongecontroleerde proliferatie begint, vindt tumorigenese plaats 1 . Uitstekende technologische vooruitgang in de genetica en moleculaire biologie heeft de afgelopen decennia opmerkelijke vooruitgang geboekt op het gebied van kankeronderzoek. In het bijzonder zijn recente studies met behulp van de analysemethoden voor genetisch mozaïekanalyse in Drosophila melanogaster , zoals FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase target) mitotisch recombinAtion 2 en flip-out-GAL4-UAS (stroomopwaartse activerende sequentie) systemen 3 hebben veel bijgedragen tot een beter begrip van de genetische mechanismen die betrokken zijn bij de vorming en metastase van tumoren 4 , 5 , 6 .
Studies van een groep geconserveerde Drosophila tumor-suppressor genen, dodelijke reuzenlarven ( lgl ), schijven groot ( dlg ) en scribble ( scrib ), benadrukte de kritische relatie tussen verlies van epitheliale organisatie en tumorontwikkeling, aangezien deze genen sleutelrollen spelen In de regulering van apical-basale celpolariteit en cel proliferatie in epitheliale weefsels 7 . Terwijl Drosophila imaginal discs normaal gesproken een gelaagde epithelia zijn, veroorzaken homozygote mutaties in elk van deze drie genen cellen om structuur en polariteit te verliezen, misluktVerhuren, overpresteren en uiteindelijk vormen multilayerige amorfe massa's die samenvoegen met aangrenzende weefsels 7 . Op soortgelijke wijze is verstoring van deze genen bij zoogdieren betrokken bij de ontwikkeling van kwaadaardige tumoren 8 , 9 . De neoplastische fenotypen die door de mutante weefsels worden tentoongesteld hebben geleid tot de indeling van deze drie genen als geconserveerde neoplastische tumor-suppressor genen (nTSG's) 7 , 8 . Wanneer echter homozygote nTSG-mutante cellen sporadisch worden gegenereerd bij het ontwikkelen van wild-type imaginale schijven met behulp van FLP-FRT-gemedieerde mitotische recombinatie, worden mutante cellen geëlimineerd uit het weefsel door middel van c-Jun N-terminale kinase (JNK) -afhankelijke apoptose 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , extrusie 15 </suP> , 16 of engulfment en fagocytose door buren 17 . In deze genetische mozaïekepithelia wordt apoptose meestal gedetecteerd in nTSG-mutante cellen die zich bevinden op de kloongrens, wat suggereert dat naastliggende normale cellen de apoptose van nTSG-mutante cellen 10 , 11 , 12 , 18 triggen. Recente studies in zoogdiercellen hebben bevestigd dat deze celcompetitieafhankelijke eliminatie van pro-tumorcellen een evolutionair bewaard epitheliaal zelfverdediging mechanisme tegen kanker 19 , 20 , 21 , 22 , 23 is .
Een recente studie in Drosophila imaginal discs bleek echter dat mozaïek nTSG-knockdown klonen neoplastische tumoren in specifiekeIc regio's van vleugel imaginale schijven 16 . Aanvankelijke tumorvorming werd altijd gevonden in het perifere "scharnier" gebied en werd nooit waargenomen in het centrale "pouch" gebied van het vleugelplatenepithelium, wat suggereert dat het tumorigene potentieel van nTSG-knockdowncellen afhankelijk is van de lokale omgeving. De centrale zakstreek fungeert als een "tumorkoolspot" waar pro-tumorcellen geen dysplastische overgroei vertonen, terwijl het perifere scharniergebied zich gedraagt als een "tumor hotspot" 16 . In de "koude spleten" -zakkenregio's delamineren de NTSG-knockdown-cellen van de basale zijde en ondergaan apoptose. Daarentegen, als "hotspot" scharniercellen beschikken over een netwerk van robuuste cytoskeletale structuren op hun basale zijkanten, delamineren nTSG-knockdowncellen van de apicale kant van het epithelium en initiëren tumorigenische overgroei 16 . Daarom vereist analyse van tumorfenotypen in imaginale schijven zorgvuldige consiAfwijking van de regio-specifieke gevoeligheid voor tumorigenische stimuli.
Hier beschrijven we een protocol om neoplastische tumorvorming op te wekken in de Drosophila- vleugelbeeldschijven die gebruik maken van het GAL4-UAS- RNAi- systeem waardoor nTSG-knockdown-cellen worden gegenereerd in normale vleugelplaten epithelia. Hoewel deze experimentele systemen nuttig zijn om de vroege stadia van kanker te bestuderen, is een duidelijke classificatiemethode om de stadia van tumorprogressie in imaginale disc epithelia te evalueren nog niet duidelijk beschreven. Daarom stellen we ook een diagnose-methode voor om pro-tumorklonale fenotypes te classificeren die in de vleugelplatenepithelia geïnduceerd zijn in drie categorieën: hyperplasie (accumulatie van een te groot aantal normale verschijnende cellen met verhoogde proliferatie), dysplasie (premalignant weefsel dat bestaat uit abnormaal verschijnen Cellen) en neoplasie (goedaardige of kwaadaardige tumor samengesteld uit cellen die een abnormale verschijning hebben en abnormaal proliferatiepatroon).
Het GAL4-UAS-systeem is een van de meest krachtige genetische hulpmiddelen voor gerichte genuitdrukking in Drosophila 26 en vergemakkelijkt de tumorcelinductie en -analyse in vivo 4 sterk . Dit systeem maakt het mogelijk om klonen te genereren die afbreking van tumoronderdrukkende genen of overexpressie van oncogenen binnen het epitheliale weefsel van wildtype, een situatie die sterk overeenkomt met de initiële stadia van menselijke kanker, waar getransf…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken J. Vaughen voor kritische lezing van het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van JSPS KAKENHI Grant Numbers 26891025, 15H01500 en The Takeda Science Foundation Research Grant aan YT
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |