Drosophila imaginal disk epitelyumunda mozaik klon analizi, tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için güçlü bir model sistemidir. Burada, GAL4-UAS sistemini kullanarak Drosophila kanat imaginal disklerinde tümörleri indüklemek için bir protokolü tarif eder ve tümör fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi sunmaktayız.
Kanserin erken evrelerinde, dönüştürülmüş mutant hücreler sitolojik anormallik gösterir, kontrolsüz aşırı büyümeye başlar ve doku organizasyonunu giderek bozmaktadır. Drosophila melanogaster , tümörigenezin genetik ve hücresel mekanizmalarını incelemek için kanser biyolojisinde popüler bir deneysel model sistemi olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, Drosophila imaginal diskler için genetik araçlar (larvalarda gelişen epitel), insan kanserinin başlangıç evrelerine benzer bir durum olan normal bir epitel dokusunda dönüştürülmüş pro-tümör hücrelerinin oluşturulmasını sağlar. Bununla birlikte, Drosophila kanat imaginal disklerinde yapılan tümörigenez üzerine yakın tarihli bir çalışmada, tümör başlangıcının doku intrensek sitolojik mimarisine ve yerel mikro çevreye bağlı olduğunu göstermiştir; bu, imaginal olarak tümör fenotiplerini değerlendirmede tümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik duyarlılığın göz önüne alınmasının önemli olduğunu düşündürmektedir diskler. Tümör gelişiminin fenotipik analizini kolaylaştırmakİmaj disklerinde, burada, kanat imgesel disklerinde neoplastik tümörleri indüklemek için GAL4-UAS sistemini kullanan genetik deneyler için bir protokolü açıklıyoruz. Daha önce tarif edilmemiş olan, tümör progresyonunun çeşitli aşamalarını (hiperplazi, displazi veya neoplazi gibi) ayırt etmek için net bir sınıflandırma yöntemi olduğu için, imaginal epitelde indüklenen klonal lezyonların fenotiplerini sınıflandırmak için bir tanı yöntemi daha sunuyoruz. Bu yöntemler, Drosophila'daki çeşitli organlarda tümör fenotiplerinin klonal analizi için geniş çapta uygulanabilir.
Epitel dokuları, gelişim ve hücre döngüsü yoluyla organizasyonlarını sürdürmek için olağanüstü homeostatik kabiliyet gösteren oldukça organize sistemlerdir. Bununla birlikte, bu sağlam kendi kendini düzenleyen sistem, tümör gelişiminde aşamalı olarak bozulmaktadır. Tümör gelişiminin başlangıcında, bir onkojen aktivasyonundan ya da tümör süpresör geni inaktivasyonundan kaynaklanan mütasyona uğramış hücreler epitel tabakasında ortaya çıkar. Bu "tümör öncesi hücre", baskılanmış bir ortamdan kaçınır, epitelin düzenlenmesini bozar ve kontrolsüz çoğalmaya başlar, tümörojenez oluşur 1 . Son birkaç on yıl içinde, genetik ve moleküler biyolojideki olağanüstü teknolojik gelişmeler kanser araştırmaları konusunda kayda değer ilerlemeler kaydetti. Özellikle, Drosophila melanogasterinde genetik olarak mozaik analiz araçlarını kullanan, FLP-FRT (flippase recombinase / flippase recombinase hedefi) mitoz rekombinası gibi son çalışmalarAtion 2 ve flip-out-GAL4-UAS (upstream aktivasyon dizisi) sistemleri 3 , tümörler 4 , 5 , 6'nın oluşumu ve metastazında rol oynayan genetik mekanizmaların daha iyi anlaşılmasına büyük katkı sağladı.
Korunmuş Drosophila tümör süpresör genleri, ölümcül dev larvalar ( lgl ), büyük diskler ( dlg ) ve karalamalı ( scribble ) bir grup üzerinde yapılan çalışmalar, bu genlerin önemli rol oynadığı için epitel organizasyonu kaybı ile tümör gelişimi arasındaki kritik ilişkiyi vurguladı Epitelyal dokularda apikal-bazal hücre polaritesi ve hücre proliferasyonunun düzenlenmesinde 7 . Drosophila imaginal diskleri normal olarak tek tabaka epiteliyken, bu üç genin herhangi birindeki homozigot mutasyonlar, hücrelerin yapısını ve polaritesini kaybetmesine neden olur, farklılık oluşturmazlarKirletir, aşırı yayar ve nihayetinde komşu dokularla kaynaşan çok tabakalı amorf kütleler oluşturur 7 . Benzer bir şekilde, memelilerde, bu genlerin bozulması, kötü huylu tümörlerin 8, 9 gelişiminde ilgilenmektedir. Mutant dokular tarafından sergilenen neoplastik fenotipler, bu üç genin korunmuş, neoplastik tümör baskılayıcı genler (nTSG'ler) 7 , 8 olarak sınıflandırılmasına yol açtı. Homozigot nTSG mutant hücrelerinin düzensiz FLP FRT aracılı mitotik rekombinasyon kullanılarak vahşi tip hayali diskler geliştirilmesinde oluşturulur Bununla birlikte, mutant hücreler, c-Jun N-terminal kinazın (JNK) bağlı apoptoz 10, 11 aracılığıyla dokunun elenir , 12 , 13 , 14 , ekstrüzyon 15 </suP> , 16 veya komşular tarafından yutkunma ve fagositoz 17 . Bu genetik olarak mozaik epitelyumda, apoptoz çoğunlukla klon sınırında yer alan nTSG mutant hücrelerinde saptanır ve bitişik normal hücrelerin nTSG mutant hücrelerinin apoptozunu tetiklediğini düşündürür. Bu , 10 , 11 , 12 , 18 . Memeli hücrelerinde yapılan son çalışmalar bu tümör öncesi hücrelerin hücre rekabetine bağlı eliminasyonunun kansere karşı evrimsel olarak korunmuş epitelyal bir kendini savunma mekanizması olduğunu doğruladı 19 , 20 , 21 , 22 , 23 .
Bununla birlikte, Drosophila imaginal disklerinde yapılan yeni bir çalışmada, mozaik nTSG knockdown klonlarının spesifik olarak neoplastik tümörleri indüklediği gösterilmiştirKanat imgesel disklerin buz bölgeleri 16 . Başlangıçtaki tümör oluşumu periferik "menteşe" bölgesinde daima bulundu ve kanat disk epitelinin merkezi "kese" bölgesinde asla gözlenmedi, bu, nTSG knockdown hücrelerinin tümörojenik potansiyelinin yerel ortama bağlı olduğunu düşündürdü. Merkezi kese bölgesi, pro-tümör hücrelerinin displastik aşırı büyüme göstermediği bir "tümör soğuk noktası" olarak işlev görürken, çevresel menteşe bölgesi "tümör sıcak noktası" olarak davranır 16 . "Soğuk nokta" kese bölgelerinde, nTSG knockdown hücreleri bazal taraftan laminatlaşır ve apoptozise girer. Aksine, "sıcak nokta" menteşe hücreleri, bazal yanlarında sağlam bir sitokkelet yapıları ağı bulunduğundan, nTSG knockdown hücreleri epitelin apikal yanından kat katlanır ve tümöre özgü aşırı büyümeyi başlatır 16 . Bu nedenle, imgesel disklerdeki tümör fenotiplerinin analizi dikkatli bir şekilde yapılmasını gerektirirTümöre özgü uyarılara bölgeye spesifik yatkınlığın azalması.
Burada, normal kanat disk epitelinde nTSG knockdown hücrelerinin üretildiği GAL4-UAS- RNAi sistemini kullanan Drosophila kanat imaginal disklerinde neoplastik tümör oluşumunu indükleyen bir protokolü açıkladık. Bu deneysel sistemler kanserin erken safhalarını incelemek için yararlı olsa da, imaginal disk epitelyumundaki tümör progresyon evrelerini değerlendirmek için açık bir sınıflandırma yöntemi daha önce açıklanamamıştır. Bu nedenle, kanat diski epitelyumunda indüklenen tümör öncesi klonal fenotipleri üç kategoriye ayırmak için bir teşhis metodu öneriyoruz: Hiperplazi (artmış proliferasyonu olan aşırı miktarda normal görünen hücrelerin birikimi), displazi (anormal olarak görülen premalign doku Hücreler) ve neoplazi (benign veya malign tümör, anormal görünüm ve anormal proliferasyon paternine sahip hücrelerden oluşur).
GAL4-UAS sistemi, Drosophila 26'da hedef gen ekspresyonu için en güçlü genetik araçlardan biridir ve in vivo tümör hücresi indüksiyonu ve analizini büyük ölçüde kolaylaştırır 4 . Bu sistem, transforme edilmiş pro-tümör hücrelerinin normal epitel hücreleri tarafından çevrelendiği insan kanserinin başlangıç aşamalarına oldukça benzer bir durum olan, vahşi tipli epitel dokusunda tümör baskılayıcı genlerin dökü…
The authors have nothing to disclose.
Makalenin eleştirel okunması için J. Vaughen'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, JSPS KAKENHI Grant Numaraları 26891025, 15H01500 ve YT'ye Takeda Bilim Vakfı Araştırma Yardımı hibeleri tarafından desteklenmiştir.
Reagents | |||
Phosphate buffered saline (PBS) | Wako | 162-19321 | |
TritonX-100 | Wako | 168-11805 | |
Formaldehyde | Wako | 064-00406 | |
bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
normal goat serum | Sigma | G6767 | |
mounting medium, Vectashield | Vector Laboratories | H-1000 | |
DAPI | Sigma | D9542 | |
mouse-anti-Dlg 4F3 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 anti-discs large, RRID:AB_528203 | dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3A6B4, RRID:AB_579780 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 3B8D12, RRID:AB_579781 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-MMP1 | Developmental Studies Hybridoma Bank | 5H7B11, RRID:AB_579779 | 3 mixed 1:1:1 and dilute in PBTG, 1:40 |
mouse-anti-atubulin | Developmental Studies Hybridoma Bank | AA4.3, RRID:AB_579793 | dilute in PBTG, 1:100 |
Alexa Fluor 546 Phalloidin | Molecular probes | A22283 | dilute in PBS, 1:40 |
goat anti-mouse IgG antibody, Alexa Fluor 546 | Molecular probes | A11030 | dilute in PBTG, 1:400 |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Fly strains | |||
sd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #8609 | recombined with UAS-EGFP |
upd-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | #26796 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-lgl-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #51247 | |
UAS-scrib-RNAi | Vienna Drosophila RNAi center | #105412 | |
UAS-RasV12 | Bloomington Drosophila Stock Center | #64196 | |
UAS-Yki3SA | Bloomington Drosophila Stock Center | #28817 | |
hsFLP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6 | |
Act>CD2>GAL4 (flip-out GAL4) | Bloomington Drosophila Stock Center | #4780 | recombined with UAS-EGFP |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #5428 | X chromosome |
UAS-EGFP | Bloomington Drosophila Stock Center | #6658 | third chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24650 | second chromosome |
UAS-Dicer2 | Bloomington Drosophila Stock Center | #24651 | third chromosome |
vkg-GFP | Morin et al. 2001 | GFP protein trap |