Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

ا Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

هنا، نقدم كاينورهابديتيس ايليجانس مقايسة محددة تهدف إلى تقييم التغيرات في السلوك النفور النحاس والقدرة على تحديد مصدر الغذاء المشترك، كما تقدم الكائن الحي من تغذية جيدة إلى حالة غذائية جوعا.

Abstract

ولضمان البقاء، يجب أن تكون الكائنات الحية قادرة على تجنب الموائل غير المواتية مع ضمان مصدر غذائي متسق. كاينورهابديتيس إليغانز يغير أنماطها الحركية عند الكشف عن المحفزات البيئية المتنوعة ويمكن تعديل مجموعة من الاستجابات السلوكية استجابة لظروف المجاعة. الديدان الخيطية عادة ما تظهر استجابة أفرسيف انخفاض عند إزالتها من مصدر الغذاء لأكثر من 30 دقيقة. إن مراقبة التغيرات السلوكية استجابة لحالة تغذوية متغيرة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة للآليات التي تنظم الانتقال من حالة تغذى جيدا إلى حالة جوع.

لقد طورنا مقايسة تقيس قدرة النيماتودا على عبور حاجز منعكس ( أي النحاس) ثم تصل إلى مصدر غذائي على مدى فترة طويلة من الزمن. ويستند هذا البروتوكول على العمل السابق من خلال دمج متغيرات متعددة في الطريقة التي تسمح لجمع البيانات المستمر مع تحول الكائنات نحو أن حالة جوعا على نحو متزايد. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا الفحص زيادة حجم العينة بحيث يمكن تقييم أكبر عدد من الديدان الخيطية في وقت واحد.

الكائنات الحية المعيبة من أجل القدرة على كشف أو الاستجابة للنحاس عبور الحاجز الكيميائي على الفور، في حين أن النيماتودا البرية نوع صدت في البداية. كما الديدان نوع البرية جوعا على نحو متزايد، فإنها تبدأ في عبور الحاجز والوصول إلى مصدر الغذاء. قمنا بتصميم هذا الفحص لتقييم متحولة التي هي غير قادرة على الاستجابة إلى الإشارات البيئية المتنوعة، بما في ذلك الإحساس الغذاء أو الكشف عن المواد الكيميائية نافر. عند تقييمها عبر هذا البروتوكول، عبرت الكائنات المعيبة على الفور الحاجز، ولكن أيضا غير قادرة على الكشف عن مصدر الغذاء. ومن ثم، فإن هذه المسوخ تعبر مرارا الحاجز الكيميائي على الرغم من الوصول مؤقتا إلى مصدر غذائي. هذا الاختبار يمكن اختبار مجموعات من الديدان بشكل مباشر لتقييم العيوب المسار المحتملة المتعلقة النفور والمجاعة.

Introduction

وقد استخدمت كاينورهابديتيس ايليجانس كنموذج لدراسة علم الأعصاب لعقود بسبب السهولة النسبية في تحليل الدوائر من الجهاز العصبي تتألف فقط من 302 الخلايا العصبية 1 . شريطة أن يكون الكائن يعتمد على الاستجابة للإشارات البيئية، وكثير من الجهاز العصبي مكرس لتنظيم دمج الإشارات البيئية 2 . على الرغم من بساطة الجهاز العصبي، C. ايليجانس يمكن الكشف عن والرد على إشارات بيئية متنوعة بما في ذلك طارد 3 ، وجذابات 4 ، ودرجة الحرارة 5 ، وحتى الرطوبة 6 . وقد تم ربط الفشل في دمج صحيح إشارات بيئية لعدد من الاضطرابات السلوكية والشروط الاعصاب في النظم نموذج الثدييات 7- 9. مع مجموعة من نماذج الأمراض العصبية المتاحة 10 في C. ايليجانس وتطوير شاشات الأدوية النيماتودا 11 ، وقد أثبت هذا الكائن ليكون نظاما مفيدا لدراسة علم الأعصاب. وبالنظر إلى توافر نيماتودا خريطة الاتصال 1 والطفرات إلى كل جين تقريبا في الجينوم الديدان الخيطية 12 ، فهمنا للجهاز العصبي النيماتودا، وبتوسيع منطقتنا، ويقتصر جزئيا من خلال تصميم المقايسات المناسبة خلاق.

وقد تم تطوير عدد من فحوصات الكيميائي على مدى السنوات ال 40 الماضية لتقييم استجابة الديدان الخيطية إلى المحفزات عديمة التنوع 3 ، 4 ، 13 ، 14 ، 15 . وشملت التجارب الأولية إدخال التحفيز البيئي الحاد في حين دودة واحدة تجول على لوحة أجار= "كريف"> 3 ، 14 ، 16 . وسجلت تغييرات فورية على الاستجابات الحركية. على سبيل المثال، يمكن تطبيق الأوكتانول الرائحة متقلبة إلى الشعر وفاحت أمام أنف الخيطية لتحفيز بدء الحركة إلى الوراء في نوع الديدان البرية 17. كما تم تطوير مقايسات أكثر تعقيدا لدمج متغيرات متعددة كوسيلة لتقييم الخيار السلوكي 18 . الاختلاف من هذا الفحص ينطوي على استخدام حل النحاس لخلق حاجز خط الوسط نافيريزيف 4 . وقد وضعت جاذبة، وهي الدياستيل، على جانب واحد من الحاجز الكيميائي مع نقل الديدان بعيدا عن مصدر الدياستيل. وعبرت الديدان المعيبة لاستجابات النحاسية النحاسية على الفور الحاجز للوصول إلى الدياستيل، في حين أن الديدان ذات النوع البري قد صدت في البداية بواسطة الحاجز. وسجلت الردود عندما اقتربت الديدان أولا حاجز النحاسدون ملاحظات طويلة الأجل.

عندما يتم تقييم الديدان بعد خضوعها لظروف المجاعة، تنخفض حساسيتها للمؤثرات البيئية 19 . عندما يطفو الأوكتانول الكيميائي الأستراني أمام الأنف الديدان الخيطية، الكائنات الحية البرية تحفز الحركة إلى الوراء في غضون 3-5 سنوات عندما على الغذاء. بعد إزالة هذه الكائنات من الطعام لمدة 10 دقيقة، فإنها تظهر استجابة متأخرة من 8-10 ثانية 20 . وهكذا، مع زيادة المجاعة، تظهر الديدان الخيطية استجابة ناقصة منخفضة للإشارات البيئية الضارة حيث أن البحث عن الغذاء يصبح أكثر أهمية للبقاء على قيد الحياة. على العكس من ذلك، الديدان الخيطية التي تزيد من التعبير عن مستقبلات نيوروببتيد 9 ( نبر-9) ، لا تستجيب للأوكتانول على أو خارج الطعام وتعرض عدم القدرة على الاستجابة لعدد من المحفزات تافهة 21 . هذه الكائنات نبر-9 (غف) أيضا لا تعدل تردد عكسها في وجود الطعام، ولكن يمكنعكس ردا على التحفيز لمسة قاسية تشير إلى أنها قادرة على التحرك إلى الوراء 21 . كما قمنا بتقييم نبر-9 (لف) المسوخ نظرا لأنها تظهر بشكل غير طبيعي انخفاض تردد عكس من الطعام بعد يمكن تعديل سلوكهم في وجود الغذاء 21 . وقد ساعدت اقتران الحالة الغذائية للدودة مع إدخال المحفزات الخارجية الحادة في توضيح الآليات التي من خلالها مسار ذات الصلة الغذائية يمكن أن تعدل على نطاق واسع مسارات الإشارات الحسية 22 ، 23 . كما تم استخدام الغذاء في بيئة الديدان الخيطية لتقييم ردود الانسحاب من الإيثانول 24 . في هذه التجربة، تم تحضين الديدان في تركيزات مختلفة من الإيثانول ثم وضعت على لوحة أجار مع رقعة من المواد الغذائية المعروفة باسم "مقايسة سباق الغذاء". تم وضع التصحيح الغذائي على حافة واحدة من لوحة بينما الديدان الخيطية ثتوضع بعيدا عن مصدر الغذاء. تم تقييم الانسحاب الإيثانول عن طريق قياس مدة الوقت اللازم للديدان للوصول إلى التصحيح من المواد الغذائية.

هذا الاختبار القائم على التغذية النفور النحاس يبني على مقايسة سباق الغذاء لدمج المتغيرات البيئية إضافية، وهي الغذاء والنحاس، في حين أن تقييم التغيرات السلوكية مع مرور الوقت. هذا هو التكيف من استخدام بروتوكول شائع في جميع أنحاء C. ايليجانس المجتمع 4 . وقد استخدم هذا البروتوكول لتقييم ردود نافيريزيف والكشف عن الطعام على مدى فترة أربع ساعات 21 . وبما أن سلوك دودة معرض الجوع بعد 30 دقيقة من الحرمان الغذائي 25 ، ونحن أيضا قادرون على تقييم كيف يمكن للتغيرات في الوضع التغذوي أن تؤثر على الاستجابات البيئية. شروط هذا المقياس قياس كيف الكائنات التجريبية تغيير الاستجابة للمؤثرات تافهة مع مرور الوقت، وبالتالي هذا يقيم التغيرات السلوكية كماتقدم الكائنات الحية نحو حالة جائعة (والقياسات المستمرة للمجاعة لفترات طويلة). منذ الحيوانات NPR-9 (GF) لا تغير سلوكهم في الاستجابة للطعام أو العديد من الإشارات مكره، سعينا إلى تحديد ما إذا كانت هذه العجز السلوكية سيستمر في سياق الموت جوعا. في نهاية المطاف، وقد وضعت هذا التصميم مقايسة على وجه التحديد لتقييم المسوخ نبر-9 (غف) ولكن يمكن أن تتكيف كذلك لتوصيف أيضا سلالات الرواية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكائنات التجريبية

  1. اختيار 10 L4 نظمت الديدان الخيطية لكل سلالة 24 ساعة قبل بدء الفحص للتأكد من أن الكائنات الحية هي الشباب عند اختبارها. لكل اختبار متحولة أو نيماتودا اختبار، واختيار 10 L4s (10 للسيطرة و 10 للمقايسة).
    1. الحفاظ على الكائنات الحية L4 باستخدام أساليب قياسية 26 ، 27 لمدة 24 ساعة على لوحات أجار القياسية المصنف مع OP50 الإشريكية القولونية . إذا فقدت الكائنات الحية خلال خطوات غسل لاحقة، تعويض عن طريق زيادة حجم العينة بدءا ( أي اختيار 20 الديدان بدلا من 10).
      ملاحظة: السلوك هو النمط الظاهري المتغير الفطري. تنفيذ الطريقة في ثلاث نسخ لكل سلالة على ثلاثة أيام منفصلة. وتشمل سلالات تحكم إضافية وشروط سلالات جديدة، كما هو مبين في قسم المناقشة.
  2. مباشرة قبل الفحص، ونقل أورغا التجريبيةنيسمز إلى لوحة أجار مع عدم وجود البكتيريا والسماح للديدان الخيطية على التحرك بحرية لمدة 1 دقيقة لإزالة البكتيريا الزائدة.
    1. إذا واجهت الكائنات التجريبية ظروف التلوث خلال 24 ساعة قبل الفحص، تجاهل لهم.
  3. ماصة 1 مل من M9 على لوحة خالية من البكتيريا لغسل الديدان إلى أنبوب ميكروسنتريفوج.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 3000 x ج لمدة 1 دقيقة. يجب أن تشكل الديدان بيليه في الجزء السفلي من الأنبوب. نضح M9 الحل دون تعطيل بيليه دودة. إضافة 1 مل من M9 إلى بيليه دودة، عكس أنبوب لخلط الديدان مع الحل.
  5. كرر الخطوات 1.4 ثلاث مرات أخرى.
    1. إذا تم نقل البكتيريا الزائدة في البداية مع الديدان، كرر ما مجموعه 5 مرات. لا ينبغي نقل البكتيريا إلى لوحات سباق الغذاء النحاس. إذا تم نقل الطعام إلى لوحة الفحص، وسوف تتداخل مع جمع البيانات دقيقة.
  6. بعد غسل النهائي، نضح طاف حتى 10081؛ L من M9 وبيليه دودة يبقى.
    الحذر: السلوكيات المجاعة ذات الصلة تصبح واضحة بعد 30 دقيقة. وبالتالي ينبغي نقل الديدان فورا من الحل بمجرد الانتهاء من خطوات الغسيل.

2. إعداد لوحات الفحص

  1. إعداد القياسية لوحات نغم أجار قبل يومين من الفحص.
    1. إذا تم الاحتفاظ لوحات في بيئة رطبة، وجعل لوحات أجار 3 أيام قبل الفحص. بدلا من ذلك، إزالة غطاء لوحة لمدة 3-6 ح لضمان الجفاف السليم (إذا كان في بيئة معقمة).
  2. مع علامة دائمة سميكة، وجعل خط على الجانب السفلي من لوحة على طول الحافة الخارجية وآخر لتشكيل حاجز منتصف خط ( الشكل 1 ). يجب أن يكون حاجز خط الوسط متساوي البعد عن كل حافة اللوحة. استخدام مسطرة لضمان قياسات دقيقة. هذه الخطوط سوف تكون بمثابة دليل عند نقل البكتيريا ومحلول النحاس. بشرطيتم نقل E. القولونية قبل حل النحاس، وهذه الخطوط بمثابة مؤشرات.
  3. لوحة البذور مع 50 ميكرولتر من OP50 E. القولونية على جانب واحد فقط من حاجز النحاس لإنشاء حديقة موحدة ( الشكل 2 ). وينبغي أن يبقى تركيز البكتيريا متسقة عبر المقايسات. ومع ذلك، لوحظ القليل من التباين استجابة للفروق الخفيفة في التركيز.
    1. استخدام خطوط ملحوظ على الجانب السفلي من لوحة لضمان البكتيريا لا تتلامس مع حل النحاس. شريطة أن حل النحاس خطوط حافة لوحة ويشكل حاجز منتصف الخط، ونقل البكتيريا بحيث لن يكون حل النحاس في اتصال مع مصدر الغذاء.
  4. علامة مجموعة ثانية من لوحات ونقل أي OP50 E. القولونية لهم ( الشكل 2 ). هذه اللوحات سوف تعمل على تقييم السيطرة السلبية. وينبغي أن يكون لهذه اللوحات أيضاووضع علامة على نصف لوحة للدلالة على الأصل نقل الأولي.
  5. السماح للبكتيريا لتجف ثم احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. تأكد من أن البقع البكتيرية لا تنزعج عند نقلها إلى حاضنة أو غرفة 37 درجة مئوية. الاضطراب المفرط يمكن أن يغير موقع أو شكل التصحيح الغذائي.

3. فحص الكيميائي

  1. إعداد الطازجة 0.5 M النحاس (إي) محلول كبريتات قبل الفحص وقت البدء. شريطة أن يتم استخدام 125 ميكرولتر من الحل لكل لوحة، توسيع نطاق هذا الحجم يعتمد على عدد لوحات الفحص المستخدمة (على سبيل المثال 5 لوحات الفحص، 625 ميكرولتر).
  2. ماصة 100 ميكرولتر من النحاس (إي) محلول كبريتات على حافة أجار لإنشاء حاجز النحاس الخارجي. وينبغي أن يكون الجانب السفلي ملحوظ من لوحة بمثابة دليل.
  3. ماصة 25 ميكرولتر من محلول النحاس (إي) كبريتات لإنشاء حاجز خط الوسط.
    1. تأكد من أن النحاس (إي) محلول كبريتات القيام بهإس لا تتلامس مع التصحيح البكتيري. استخدام تقنية رصدت كما تسليط الضوء قد تؤثر على الحركة بسبب إندنتاتيونس / الخدوش على أجار.
  4. السماح حل النحاس لتجف على لوحة. الفترة الزمنية يمكن أن تختلف اعتمادا على لوحة وظروف المختبر. تحقق بصريا لجفاف كل 5 دقائق بعد نقل.
    ملاحظة: الحل النحاس يعرض لون زرقاء ويمكن التعرف عليها بسهولة. استخدام الأنسجة المختبرية ل داب طفيفة الحل بالقرب من حافة لوحة لتمييز جفاف.
  5. ماصة 20 ميكرولتر من بيليه دودة من الجزء السفلي من الأنبوب على نصف خالية من البكتيريا لوحة الفحص.
    1. تأكد من أن 10 الديدان يتم نقلها إلى لوحة الفحص. إذا تم تضمين الديدان الزائدة عن طريق الخطأ، وإزالتها عن طريق التقاط مع زيت الهالوكربون لضمان عدم إضافة أي بكتيريا إلى لوحة. يجب أن يكون كل فحص عدد ثابت من الديدان الخيطية خلال الفحص.
      ملاحظة: إذا الديدان قليلة جدا هي ترانسفخلال الفحوص، فإن زيادة حجم العينة الأولي سوف يخفف من الخسائر المحتملة أثناء الغسل والتحويلات.
  6. إزالة M9 الزائد من لوحة مع الأنسجة المختبرية. M9 يجب أن لا تتلامس مع محلول النحاس (إي) كبريتات.
    تنبيه: تأكد من أن الديدان والسطح أجار لا تتأثر أثناء تنفيذ هذه الخطوة. إذا استخدمت قاسية جدا، يمكن أن الأنسجة المختبرية تخلق المسافة البادئة إلى سطح أجار لوحة ويمكن إزالة الديدان. يجب التخلص من الديدان عن طريق الخطأ عن طريق كيمويب.
  7. مرة واحدة وقد تم إزالة الحل M9 وجميع الديدان قد بدأت أنماط الحركية غير سائلة، بدء ساعة توقيت الفحص.
    1. على النحو الأمثل، وإزالة الحل M9 في غضون دقيقة. المعلمة الأساسية هي تحديد الحركة الجيبية. الديدان تتحرك بشكل مختلف، على سبيل المثال سحق بدلا من جيبية، عندما تكون في السائل. بدء فحص مشاهدة الفحص مرة واحدة كل من الجهاز التجريبيإيسمس توقف عن سحق.
  8. فحص لوحات فحص كل 30 دقيقة.
    1. لوحات فحص مع بقع البكتيرية، يسجل إيجابيا الكائنات إذا وصلت إلى التصحيح الغذاء على مدى فترة 4 ساعات. لوحات التحكم السلبية، يسجل إيجابيا الكائنات إذا كانوا قد عبروا الحاجز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استخدمنا النوع البري (N2)، نبر-9 (tm1652)، وسلالة نفر-9 أوفيركسريسيون، أي نير-9 (غف) (IC836 - نير-9 :: نبر -9؛ سور-5 :: غفب؛ أودر -1 :: رفب)، لتقييم الردود على المجاعة والنفور النحاس. الكائنات الحية البرية قادرة على الكشف والاستجابة للحاجز النحاسي النحيف ، في حين أن نبر-9 (غف) المسوخ لا تبدأ استجابة نافذة للنحاس على مدى 4 h فحص 21 . بعد 30 دقيقة من المجاعة، ما يقرب من 50-60٪ من الكائنات البرية نوع (N2) عبور حاجز النحاس والوصول إلى التصحيح الغذاء. في علامة 2 ساعة، 75٪ من النيماتودا نوع البرية تصل إلى مصدر الغذاء. وبحلول نهاية الفحص، 100٪ من الكائنات N2 قد انتقلت إلى مصدر الغذاء. على النقيض من ذلك، فإن غالبية الكائنات النووية نبر-9 (غف) لا تعدل الأنماط الحركية في الاستجابة للأغذية وسوف تستمر في عبور حاجز نافيريزيف حتى بعد الاتصال مع الغذاءمصدر. لا تزال الديدان نبر-9 (غف) تفشل باستمرار في تغيير حركتها ردا على الغذاء على مدى 4-h الفحص و 30٪ فقط من الكائنات الحية وجدت على الغذاء في أي وقت من الأوقات. و نب-9 (لف) الحيوانات لا تؤدي وكذلك الكائنات N2، ولكن لا تعدل أنماطها الحركية كما يزيد من الجوع للوصول إلى التصحيح الغذاء ( الشكل 3 ). عندما يتم تقييم الكائنات N2 أو نير-9 (لف) عن طريق هذا الفحص بدون طعام، نادرا ما يعبرون حاجز النحاس. و نبر-9 (غف) المسوخ مرارا عبر الحاجز ذهابا وإيابا ( الشكل 4 ).

شكل 1
الشكل 1 : التمثيل المرئي للعلامات لتحديد موضع حل النحاس على الجانب السفلي من طبق بتري 5 سم. وتستخدم هذه المؤشرات لضمان ذلكوقد تم قياس أجزاء من لوحة بشكل مناسب، وتكون بمثابة المبدأ التوجيهي عند نقل البقعة البكتيرية ومن ثم حل النحاس على سطح أجار. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2 : يتم تقسيم صحن بتري 5 سم إلى قسمين لداخل وخارج لوحات فحص الغذاء وحديقة البكتيرية يتكون في مركز واحد من هذه الأقسام للوحة الطعام. يجب أن لا تتلامس التصحيح الغذائي مع مركب الاختبار الذي يرسم حواف لوحة ويشكل حاجز خط الوسط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<p كلاس = "jove_content" فو: كيب-together.within-بادج = "1"> الشكل 3
الشكل 3 : النسبة المئوية ل N2، نبر-9 (tm1652)، و نبر-9 (غف) الديدان التي تصل إلى مصدر الغذاء على مدى أربع ساعات من الزمن ردا على حالة التغذوية النحاس القائم على النفور. نقاط البيانات هي متوسطات لا يقل عن ثلاث تجارب (n> 30 الديدان) أجريت في أيام منفصلة لكلا السلالات. وتعرض البيانات كمتوسط ​​± خطأ قياسي وتحليلها مع اتجاهين التدابير المتكررة أنوفا. ** p <0.01، تختلف اختلافا كبيرا عن حيوانات N2 تحت ظروف متطابقة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 4
الشكل 4 : النسبة المئوية من N2، نير-9 (tm1652) و نبر-9 (غف) W أورمز التي عبور حاجز النحاس مع عدم وجود مصدر الغذاء على مدى أربع ساعات الفحص. تم تقييم السلالات المذكورة أعلاه من أجل النفور النحاسي في غياب الغذاء. وسجلت ردود إيجابية كما عبور حاجز النحاس وتبقى على نصف غير الأصل من لوحة. نقاط البيانات هي متوسطات لا يقل عن ثلاث تجارب (n> 30 الديدان) أجريت في أيام منفصلة لكلا السلالات. يتم عرض البيانات كما يعني ± سي و 10 على الأقل الحيوانات في ثلاث تجارب مستقلة تحليلها مع اثنين من التدابير المتكررة أنوفا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

هذا التصميم مقايسة تعديل سباق سباق الغذاء 24 لتشمل حل النحاس لخلق حاجز خط الوسط نافيريزيف وحول حافة لوحة لمنع فقدان الديدان الخيطية. يتم اختبار الكائنات الحية لقدرتها على عبور حاجز منعش والوصول إلى التصحيح الغذاء على مدى فترة 4 ساعات. في سياق نبر-9 (غف) ، لقد استخدمنا هذا الفحص لتقييم كيف يمكن أن تؤثر الظروف المجاعة على ردود نادرة وكشف عن الطعام. شريطة أن كنا قد وصفت في وقت سابق نبر-9 (غف) كما عيب للاستجابة إلى المواد الغذائية و إيفرزيف العظة، ونحن الجمع بين مضاعفات العظة البيئية مع الحالة التغذوية لتقييم إذا المجاعة يمكن تعديل السلوكيات المعيبة نير-9 (غف) . ويعتمد هذا الفحص على قدرة دودة للكشف والرد على المحفزات الكيميائية والعظة الغذائية 3 ، 4 . وبالنظر إلى متغيرات متنوعة تحليلها، وظروف السابقينيجب السيطرة على الكائنات الحية الدقيقة بدقة للقضاء على عوامل مربكة. بالنسبة للمتحولات غير المعززة، أي تلك التي لها استجابة مجهولة أو غذائية غير معروفة، سيلزم استخدام سلالات تحكم إضافية. يجب أيضا تقييم السلالات المعيبة، مثل تشي-2 أو أودر-3 28 ، والمسوخ التي لا تغير الأنماط الحركية من الطعام، على سبيل المثال تف-1 29 ، بالتوازي مع التأكد من أن ظروف النحاس والمجاعة يتم التحكم فيها بشكل مناسب. وعلاوة على ذلك، لتسليط الضوء بشكل مباشر على مساهمة المجاعة للسلوك تقييمها، ويمكن أيضا وضع شروط فحص منفصلة لمزيد من الضوابط. على سبيل المثال، يمكن جوعا الديدان الخيطية مباشرة قبل الفحص ونقلها إلى لوحة فحص (مع الغذاء) لتحديد مدى سرعة الكائن الحي في حالة جائعة سوف تستجيب للنحاس والوصول إلى التصحيح الغذائي. لدينا مقايسة الحالي يسلط الضوء علىاستجابات إرسيف كما تقدم الكائنات التجريبية من تغذية جيدة إلى حالة جوعا.

فحصنا هو تعديل من شائعة الاستخدام C. ايليجانس الكيميائي فحص 4 التي تم تضمين التحفيز أقوى ( أي تركيز عال) من أجل تقييم السلوكيات على مدى فترة زمنية أطول. وبدلا من تقييم الاستجابات الفورية، يمكن استخدام هذا المقياس لقياس التغيرات في الاستجابات النادرة مع تقدم الكائنات نحو حالة جائعة (إذا تم تضمين الضوابط اللازمة). وقد استخدمت تقييمات مماثلة في غياب النحاس من أجل تقييم ردود الانسحاب من الإيثانول، أي النيماتودا تحديد مكان الغذاء، مع مرور الوقت 24 .

كما هو الحال مع أي فحص السلوكي في C. ايليجانس، والسيطرة على المتغيرات البيئية أمر ضروري لضمان نتائج قابلة للتكرار باستمرار. الكائنات الحية يجب أن تكون كلها من نفس أغه، بالنظر إلى أن الاستجابات السلوكية يمكن أن تختلف حسب العمر. وعلاوة على ذلك، فإن التغير في الوضع الغذائي للديدان يمكن أن يغير التأقلم مع ظروف المجاعة. لذلك، الديدان التجريبية لا ينبغي أن تخضع للمجاعة في أي نقطة قبل هذا البروتوكول. تجربة المجاعة من جيل الوالدين يمكن أيضا أن تؤثر السلوك السلالة 30 ؛ وبالتالي، فمن المستحسن لضمان أن الكائنات التجريبية يتم تغذية جيدة لمدة جيلين على الأقل. وعلاوة على ذلك، ينبغي أن يظل عدد الكائنات الحية المنقولة إلى لوحات الفحص متسقا بالنظر إلى أن الكثافة السكانية المحلية يمكن أن تؤثر على معدلات التشتت 31 . مرة واحدة وقد تم نقل الديدان إلى لوحات، فمن الأهمية بمكان لإزالة الحل M9 الزائد مع الأنسجة المختبرية دون الإضرار سطح أجار. وقد يتداخل التبدل مع السطح مع الأنماط الحركية العفوية. الحل الزائد يحتاج إلى إزالة بشكل مناسب قبل البدء في البداية الرسمية للالفحص للتأكد من أن السلوك سحق، أي نمط الحركية النيماتودا لوحظ في السائل، ليست موجودة. ومن المؤشرات الواضحة البحث عن سلوك الزحف.

يجب مراقبة لوحات الفحص بحيث لوحة والجفاف البكتيرية متسقة. يمكن أن تتسبب لوحات جديدة بشكل مفرط في عيوب حركية ويمكن أن تتداخل أيضا مع الكشف عن المحفزات البيئية 6 . تطبيق حلول النحاس تحتاج إلى أن تكون متسقة قدر الإمكان بحيث الحواجز نافر هي سميكة بشكل مناسب وأنها لا تتلامس مع مصدر الغذاء. تطبيق القليل جدا من حل النحاس يمكن أن يقلل من نوع البرية وقت الاستجابة نافعة، في حين أن الكثير يمكن أن تثبت القاتلة للديدان الخيطية. تهدف لسمك موحد إلى حل النحاس يعطي أفضل النتائج. إذا تم إنشاء المسافات البادئة في أجار أثناء تطبيق حل النحاس، وينبغي التخلص من لوحة الفحص. الديدان قد الجحر من خلال هذه الثقوب 32، وخاصة عندما تواجه مع مادة نادرة أو المجاعة. لضمان التوحيد لوحة بين العينات، يمكن قياس السكان المختلطة من الديدان ( أي متحولة ونوع البرية) على نفس لوحة إذا كان واحد المسمى بوضوح (على سبيل المثال عن طريق غفب).

على الرغم من أن هذا الاختبار أجريت على لوحات أجار الحجم القياسي، لوحات كبيرة يمكن استخدامها (على سبيل المثال 100 مم القطر). في هذا السيناريو، ينبغي تمديد فترة الفحص إلى 6 ساعات لتوفير الوقت الكافي لحركة الدودة. يمكن أن تسمح لوحات أكبر لاختبار عدد أكبر من السكان، ويمكن استخدامها للتحقيق في كيفية تأثير الكثافة السكانية على ردود نادرة على مدى فترات طويلة من الزمن. ويمكن أيضا إدراج المزيد من الإجراءات المتقدمة تقنيا باستخدام معدات تتبع الدودة مقترنة بمرحلة متحركة 33 . وتتبع دودة تسمح قياسات أكثر دقة والسماح لجمع متغيرات إضافية (على سبيل المثال

الفحص يمكن تكييفها بسهولة للسماح لقياس المظاهر البديلة. يمكن أن يتغير عمر الدودة للسماح للقياسات على التغيرات التي يسببها المجاعة التي يسببها الجوع. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلافات في الحالة التغذوية للديدان التجريبية يمكن أن تسمح أيضا بتحليل التعود إلى المجاعة في سياق النفور الغذائي والكيميائي. وطالما أن البروتوكولات متسقة بين مجموعات البيانات القابلة للمقارنة، فإن أي تكييف مسبق للكائنات التجريبية يمكن تقييمه من خلال مقايسة كيميائية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ليس لدينا ما نكشف عنه.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث من كندا ديسكفري منحة RGPIN36481-08 لويليام G. بندينا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314 (1165), 1-340 (1986).
  2. Bargmann, C. I. Chemosensation in C. elegans (October 25, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. , wormbook.1.123.1, http://www.wormbook.org (2006).
  3. Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans. Cell. 74 (3), 515-527 (1993).
  4. Ward, S. Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: identification of attractants and analysis of the response by use of mutants. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 70 (3), 817-821 (1973).
  5. Ramot, D., MacInnis, B. L., Goodman, M. B. Bidirectional temperature-sensing by a single thermosensory neuron in C. elegans. Nat. Neurosci. 11 (8), 908-915 (2008).
  6. Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 111 (22), 8269-8274 (2014).
  7. van Campen, J. S., et al. Sensory modulation disorders in childhood epilepsy. J. Neurodev. Disord. 7 (34), (2015).
  8. Festa, E. K., et al. Neocortical disconnectivity disrupts sensory integration in Alzheimer's disease. Neuropsych. 19 (6), 728-738 (2005).
  9. Boecker, H., et al. Sensory processing in Parkinson's and Huntington's disease: investigations with 3D H(2)(15)O-PET. Brain. 122 (9), 1651-1665 (1999).
  10. Markaki, M., Tavernarakis, N. Modeling human disease in Caenorhabditis elegans. Biotechnol. J. 5 (12), 1261-1276 (2010).
  11. O'Reilly, L. P., Luke, C. J., Perlmutter, D. H., Silverman, G. A., Pak, S. C. C. elegans in high-throughput drug discovery. Adv. Drug Deliv. Rev. 0, 247-253 (2014).
  12. Thompson, O. The million mutation project: a new approach to genetics in Caenorhabditis elegans. Genome Res. 23 (10), 1749-1762 (2013).
  13. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  14. Maricq, A. V., Peckol, E., Driscoll, M., Bargmann, C. I. Mechanosensory signaling in C. elegans mediated by the GLR-1 glutamate receptor. Nat. 378 (6552), 78-81 (1995).
  15. Chalasani, S. H., et al. Dissecting a circuit for olfactory behaviour in Caenorhabditis elegans. Nat. 450 (7166), 63-70 (2007).
  16. Hilliard, M. A., Bargmann, C. I., Bazzicalupo, P. C. elegans responds to chemical repellents by integrating sensory inputs from the head and the tail. Curr. Biol. 12 (9), 730-734 (2002).
  17. Hart, A. C., Kass, J., Shapiro, J. E., Kaplan, J. M. Distinct signaling pathways mediate touch and osmosensory responses in a polymodal sensory neuron. J. Neurosci. 19 (6), 1952-1958 (1999).
  18. Ishihara, T., et al. HEN-1, a secretory protein with an LDL receptor motif, regulates sensory integration and learning in Caenorhabditis elegans. Cell. 109 (5), 639-649 (2002).
  19. Saeki, S., Yamamoto, M., Iino, Y. Plasticity of chemotaxis revealed by paired presentation of a chemoattractant and starvation in the nematode Caenorhabditis elegans. J. Exp. Biol. 204 (10), 1757-1764 (2001).
  20. Chao, M. Y., Komatsu, H., Fukuto, H. S., Dionne, H. M., Hart, A. C. Feeding status and serotonin rapidly and reversibly modulate a Caenorhabditis elegans chemosensory circuit. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (43), 15512-15517 (2004).
  21. Campbell, J. C., Polan-Couillard, L. F., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. NPR-9, a Galanin-Like G-Protein Coupled Receptor, and GLR-1 Regulate Interneuronal Circuitry Underlying Multisensory Integration of Environmental Cues in Caenorhabdities elegans. PLoS Genet. 12 (5), (2016).
  22. Harris, G. P., et al. Three distinct amine receptors operating at different levels within the locomotory circuit are each essential for the serotonergic modulation of chemosensation in Caenorhabditis elegans. J. Neurosci. 29 (5), 1446-1456 (2009).
  23. Harris, G., et al. Dissecting the serotonergic food signal stimulating sensory-mediated aversive behavior in C. elegans. PLoS One. 6 (7), (2011).
  24. Mitchell, P., et al. A differential role for neuropeptides in acute and chronic adaptive responses to alcohol: behavioural and genetic analysis in Caenorhabditis elegans. PLoS One. 5 (5), (2010).
  25. Colbert, H. A., Bargmann, C. I. Environmental signals modulate olfactory acuity, discrimination, and memory in Caenorhabditis elegans. Learn Mem. 4 (2), 179-191 (1997).
  26. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genet. 77 (1), 71-71 (1974).
  27. Behavior (July 3, 2006). The C. elegans Research Community, WormBook. Hart, A. C. , wormbook.1.87.1, http://www.wormbook.org (2006).
  28. Sambongi, Y., et al. Sensing of cadmium and copper ions by externally exposed ADL, ASE, ASH neurons elicits avoidance response in Caenorhabditis elegans. NeuroReport. 10 (4), 753-757 (1999).
  29. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 102 (9), 3184-3191 (2004).
  30. Rechavi, O., et al. Starvation-Induced Transgenerational Inheritance of Small RNAs in C. elegans. Cell. 158 (2), 277-287 (2014).
  31. Gloria-Soria, A., Azevedo, R. B. R. npr-1 Regulates Foraging and Dispersal Strategies in Caenorhabditis elegans. Cell. 18 (21), 1694-1699 (2008).
  32. Beron, C., et al. The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: A new assay for the study of neuromuscular disorders. Genes Brain Behav. 14 (4), 357-368 (2015).
  33. Wang, S. J., Wang, Z. W. Track-A-Worm, An Open-Source System for Quantitative Assessment of C. elegans Locomotory and Bending Behavior. PLoS One. 8 (7), (2013).

Tags

علم الأعصاب، العدد 125،
ا<em&gt; كاينورهابديتيس ايليجانس</em&gt; الوضع الغذائي القائم على النحاس النفور الفحص
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D.,… More

Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter