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Neuroscience

ए Published: July 26, 2017 doi: 10.3791/55939
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biology, Queen's University, 2Centre for Neuroscience, Queen's University

Summary

यहां, हम एक कैनोबाबाइटिटिस एलिगेंस पेश करते हैं-विशिष्ट तांबे के व्यवहार में परिवर्तन और एक आम खाद्य स्रोत का पता लगाने की क्षमता के मूल्यांकन के लिए डिजाइन किए जाने वाले विशिष्ट परीक्षण, क्योंकि जीव एक अच्छी तरह से खिलाया से भूखे पोषण राज्य से बढ़ता है।

Abstract

जीवित रहने के लिए सुनिश्चित करने के लिए, जीवित रूप से गैरकानूनी आवासों से बचने में सक्षम होना चाहिए, जबकि सुसंगत खाद्य स्रोत सुनिश्चित करना। कैनोरोबाडितास एलिगेंस विविध पर्यावरणीय उत्तेजनाओं का पता लगाने के लिए अपने लोकोमोटरी पैटर्न को बदलते हैं और भुखमरी की स्थिति के जवाब में व्यवहारिक प्रतिक्रियाओं के अपने सूट को नियंत्रित कर सकते हैं। निमेटोड्स आमतौर पर 30% से अधिक मिनट के लिए भोजन स्रोत से हटाए जाने पर कम आवेगपूर्ण प्रतिक्रिया दिखाते हैं। बदलते पोषण संबंधी स्थिति के जवाब में व्यवहार में परिवर्तन का अवलोकन तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है जो संक्रमण को एक अच्छी तरह से खिलाया से भूखे राज्य में नियंत्रित करता है।

हमने एक परख विकसित किया है जो एक निरोधी बाधा ( यानी तांबे) को पार करने की क्षमता को मापता है, फिर एक लंबे समय तक खाद्य स्रोत तक पहुंचता है। यह प्रोटोकॉल पिछले चर पर एक तरह से कई चर को एकीकरण करके बनाता है जो निरंतर डेटा संग्रहण के लिए अनुमति देता है क्योंकि जीव एक की ओर बढ़ते हैंN तेजी से भूखे स्थिति इसके अलावा, यह परख एक बढ़ी हुई नमूना आकार की अनुमति देता है ताकि नेमाटोड की बड़ी आबादी को एक साथ मूल्यांकन किया जा सके।

तांबा का पता लगाने या उसका जवाब देने की क्षमता के लिए दोषपूर्ण जीवों ने तुरंत रासायनिक बाधा को पार किया है, जबकि जंगली प्रकार के नेमाटोड को शुरू में repelled किया गया है। चूंकि जंगली प्रकार की कीड़े तेजी से भूखे हैं, वे बाधा को पार करने और खाद्य स्रोत तक पहुंचने लगते हैं। हमने एक उत्परिवर्ती का मूल्यांकन करने के लिए इस परख तैयार किया है जो विविध पर्यावरणीय संकेतों पर प्रतिक्रिया देने में असमर्थ है, जिसमें खाद्य उत्तेजना या अनावर्ती रसायनों का पता लगाना शामिल है। इस प्रोटोकॉल के माध्यम से मूल्यांकन किए जाने पर, दोषपूर्ण जीवों ने तुरंत बाधा पार कर ली, लेकिन खाद्य स्रोत का पता लगाने में भी असमर्थ थे। इसलिए, अस्थायी रूप से भोजन स्रोत तक पहुंचने के बावजूद इन म्यूटेंट बार-बार रासायनिक बाधा पार कर जाते हैं। यह परख सरलता से कीड़े की आबादी का परीक्षण करने के लिए अभाव और भुखमरी से संबंधित संभावित मार्ग दोषों का मूल्यांकन कर सकता है।

Introduction

केवल 302 न्यूरॉन्स 1 से बना तंत्रिका तंत्र की सर्किट्री के विश्लेषण में सापेक्षिक आसानी के कारण दशकों तक कैरोबाहैडाइटिस एलिगेंस का उपयोग न्युरोबायोलॉजी के अध्ययन के लिए किया गया है। बशर्ते जीव पर्यावरणीय संकेतों पर प्रतिक्रिया देने पर भरोसा करता है, तंत्रिका तंत्र के अधिकांश पर्यावरण संकेतों के एकीकरण को विनियमित करने के लिए समर्पित है 2 । इसकी तंत्रिका तंत्र की सादगी के बावजूद, सी। एलिगेंस 3 पर्यावरण के विभिन्न पर्यावरण संकेतों का पता लगा सकते हैं और जवाब दे सकते हैं 3 , आकर्षक 4 , तापमान 5 और यहां तक ​​कि आर्द्रता 6 भी। पर्यावरणीय संकेतों को ठीक से एकीकृत करने में विफलता कई प्रकार के व्यवहार संबंधी विकारों और स्तनधारी मॉडल प्रणालियों में neurodegenerative शर्तों से जुड़ी हुई है 7- 9 उपलब्ध न्यूरल रोग मॉडल की एक श्रृंखला के साथ सी। एलिगेंस में 10 और नीमेटोड फार्मास्यूटिकल स्क्रीन 11 के विकास, यह जीव तंत्रिका जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए एक उपयोगी प्रणाली साबित हुआ है। नेमेटोड जीनोम 12 में लगभग प्रत्येक जीन के लिए मैमेटेड नेमेटोड कनेक्टिअम 1 की उपलब्धता और म्यूटेशन की उपलब्धता को देखते हुए, नेमेटोड तंत्रिका तंत्र की हमारी समझ और हमारी अपनी विस्तार से, रचनात्मक रूप से उपयुक्त assays के डिजाइन द्वारा आंशिक रूप से सीमित है।

3 , 4 , 13 , 14 , 15 के विविध उत्पीड़न उत्तेजनाओं के लिए नेमेटोड जवाबदेही का मूल्यांकन करने के लिए पिछले 40 वर्षों में कई चीमोटैक्सिस assays विकसित किए गए हैं। प्रारंभिक प्रयोग में एक तीव्र पर्यावरण उत्तेजना की शुरुआत शामिल थी, जबकि एक कीड़ा एक अगर प्लेट पर घूमती थी= "Xref"> 3 , 14 , 16 Locomotory प्रतिक्रियाओं में तत्काल परिवर्तन दर्ज किए गए थे। उदाहरण के लिए, वाष्पशील odorant octanol को बालों के लिए लागू किया जा सकता है और नेमेटोड के नाक के सामने जंगली प्रकार कीड़े 17 में पीछे की तरफ की गति को प्रेरित करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है। अधिक जटिल assays भी व्यवहार विकल्प का आकलन करने के साधन के रूप में कई चर को शामिल करने के लिए विकसित किया गया है 18 इस परख के एक भिन्नता में एक तांबे के समाधान का इस्तेमाल होता है ताकि एक उत्परिवर्ती मिडलाइन बाधा 4 बन सके एक आकर्षित करने वाला, अर्थात् डायएक्टाइल, डायैसिटेबल स्रोत से दूर की गई कीड़े के साथ रासायनिक बाधा के एक तरफ रखा गया था। तांबे के विकृत प्रतिक्रियाओं के लिए दोषपूर्ण विक्रय तत्काल तीक्ष्णता तक पहुंचने के लिए बाधा को पार कर गया, जबकि जंगली प्रकार के कीड़ों को शुरू में बाधा से खारिज किया गया। प्रतिक्रियाएं तब बनीं जब कीड़े पहले तांबे के अवरोध तक पहुंच गए थेदीर्घकालिक अवलोकन के बिना

जब भुखमरी की स्थिति से गुजरने के बाद कीड़े का मूल्यांकन किया जाता है, तो पर्यावरण उत्तेजनाओं की उनकी संवेदनशीलता 1 9 कम हो जाती है। जब नेत्रहीन नाक के सामने व्युत्पन्न रासायनिक ऑक्टाणोल खुलता है, तो जंगली प्रकार के जीवों को भोजन पर 3 से 5 के भीतर पीछे की ओर आंदोलन को उत्तेजित करता है। इन जीवों को खाने से 10 मिनट के लिए हटा दिया गया है, वे 8-10 एस 20 की देरी से प्रतिक्रिया प्रदर्शित करते हैं इस प्रकार, बढ़ती भुखमरी के साथ, नेमाटोड हानिकारक पर्यावरणीय संकेतों के लिए एक कम व्युत्पन्न प्रतिक्रिया प्रदर्शित करता है क्योंकि भोजन की तलाश बचने के लिए और अधिक आवश्यक होती है इसके विपरीत, नेरेटाटेड रिसेप्टर 9 ( एनपीआर -9) से अधिक के नेमैटोड्स , ऑक्टेनॉल का भोजन पर या बंद नहीं करते हैं और कई अशिक्षित उत्तेजनाओं 21 का जवाब देने में असमर्थता प्रदर्शित करते हैं। ये npr-9 (जीएफ) जीव भी भोजन की उपस्थिति में उनकी उलट आवृत्ति को विनियमित नहीं करते हैं, लेकिन कर सकते हैंकठोर स्पर्श उत्तेजनाओं के जवाब में उल्टा यह दर्शाता है कि वे पीछे की ओर टॉमीमोशन 21 में सक्षम हैं। हमने एनपीआर-9 (एलएफ़) म्यूटेंट का भी मूल्यांकन किया है, जो कि वे भोजन से असामान्य रूप से घटते हुए उलट आवृत्ति आवृत्ति का प्रदर्शन करते हैं लेकिन भोजन 21 की उपस्थिति में उनके व्यवहार को व्यवस्थित कर सकते हैं। तीव्र बाह्य उत्तेजनाओं की शुरूआत के साथ कृमि की पोषण स्थिति को जोड़कर तंत्र को स्पष्ट करने में मदद मिली है जिसके द्वारा भोजन से संबंधित मार्ग बड़े पैमाने पर संवेदी संकेतन पथ 22 , 23 को नियंत्रित कर सकता है। निमेटोड वातावरण में भोजन की उपस्थिति भी इथेनॉल वापसी प्रतिक्रियाओं 24 मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। इस प्रयोग में, कीटनाशक इथेनॉल की सांद्रता में अलग-अलग होते थे और फिर उन्हें "भोजन-दौड़ परख" के रूप में जाना जाता भोजन के एक पैच के साथ एक अगर प्लेट पर रखा गया था। भोजन पैच प्लेट के एक छोर पर रखा गया था जबकि नेमेटोड्स डब्ल्यूपहले खाना स्रोत से दूर रखा गया है भोजन के पैच तक पहुंचने के लिए कीटनाशकों के लिए जरूरी समय की अवधि को मापने के द्वारा इथनोल का मूल्यांकन किया गया था।

यह पोषण-आधारित तांबा व्यंग्य परख समय-समय पर व्यवहार में बदलाव का आकलन करते समय अतिरिक्त पर्यावरणीय चर, जैसे भोजन और तांबे को एकीकृत करने के लिए भोजन-दौड़ परख बनाता है। यह सी। भर में सामान्यतः उपयोग प्रोटोकॉल का अनुकूलन है । एलिगेंस समुदाय 4 इस प्रोटोकॉल का उपयोग चौंका देने वाली प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने और चार घंटे की अवधि 21 के दौरान भोजन का पता लगाने के लिए किया गया है। चूंकि कृमि के 30 दिनों के भोजन के अभाव के बाद से भूख से बचने का व्यवहार 25 है , हम यह भी मूल्यांकन करने में सक्षम हैं कि पोषण संबंधी स्थिति में परिवर्तन पर्यावरणीय प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित कर सकता है। इस परख की स्थितियों से पता चलता है कि प्रयोगात्मक जीव समय के साथ प्रतिक्रियावादी उत्तेजनाओं को प्रतिक्रिया देते हैं, इसलिए यह व्यवहार परिवर्तनों का मूल्यांकन करता हैजीव भूखे राज्य (और लंबे समय तक भूख से लगातार मापन) की दिशा में प्रगति कर रहे हैं। चूंकि एनपीआर-9 (जीएफ) जानवरों के भोजन या कई व्यभिचारिक संकेतों के जवाब में उनके व्यवहार में कोई बदलाव नहीं आया है, इसलिए हमने यह पहचानने की मांग की है कि क्या ये व्यवहार घाटा भूख के संदर्भ में जारी रहेंगे। आखिरकार, इस परख डिजाइन को विशेष रूप से एनपीआर 9 (जीएफ) म्यूटेंट का मूल्यांकन करने के लिए तैयार किया गया है, लेकिन उपन्यास उपभेदों को भी चिह्नित करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

1. प्रायोगिक जीवों की तैयारी

  1. जांचने के लिए कि जीवों के युवा वयस्क होने पर यह सुनिश्चित करने के लिए परख शुरू करने से पहले प्रत्येक ताकत पर 24 घंटे पूर्व 10 एल 4 का निमेटोड लगाया गया। प्रत्येक उत्परिवर्ती या नियंत्रित निमेटोड के लिए, 10 एल 4 (10 नियंत्रण के लिए 10 और परख के लिए 10) चुनें।
    1. OP50 Escherichia coli के साथ वरीयता प्राप्त मानक अगर प्लेटों पर 24 घंटे के लिए मानक तरीकों 26 , 27 का उपयोग करते हुए एल 4 जीवों को बनाए रखें। यदि बाद के धोने के चरणों के दौरान जीवों को खो दिया जाता है, तो प्रारंभिक नमूना आकार में वृद्धि ( जैसे कि 10 की बजाय 20 कीड़े लेने) की भरपाई करें।
      नोट: व्यवहार एक सहज रूप से चर phenotype है तीन अलग-अलग दिनों पर प्रत्येक तनाव के लिए विधि प्रतिरूप करें चर्चा अनुभाग में हाइलाइट के रूप में, उपन्यास उपभेदों के लिए अतिरिक्त नियंत्रण उपभेदों और शर्तों को शामिल करें।
  2. परख से तत्काल, प्रायोगिक संगठनों को स्थानांतरित करेंबिना बैक्टीरिया के एक अगर प्लेट में नस्सियों और नेमाटोड अतिरिक्त बैक्टीरिया को हटाने के लिए 1 मिनट के लिए स्वतंत्र रूप से स्थानांतरित करने के लिए अनुमति देते हैं।
    1. यदि प्रायोगिक जीवों परख से पहले 24 घंटे के दौरान प्रदूषण की स्थिति का अनुभव किया जाता है, तो उन्हें त्याग दें।
  3. माइक्रोसॉसिटर ट्यूब में कीड़े को धोने के लिए जीवाणु-मुक्त प्लेट पर एम 9 के पिपेट 1 एमएल।
  4. 1 मिनट के लिए 3,000 xg पर अपकेंद्रित्र कीड़े ट्यूब के निचले हिस्से में एक गोली बनानी चाहिए। कीड़ा गोली में बाधा डालने के बिना एम 9 समाधान की आकांक्षा। कृमि गोली में 1 एमएल का एमएल जोड़ें, समाधान के साथ कीड़े मिश्रण करने के लिए ट्यूब उलटना।
  5. दोहराएं चरण 1.4 तीन और बार
    1. यदि अतिरिक्त जीवाणुओं को शुरू में कीड़े के साथ स्थानांतरित किया गया था, तो कुल 5 बार के लिए दोहराएं। कोई बैक्टीरिया को तांबे की खाद्य दौड़ प्लेटों में स्थानांतरित नहीं किया जाना चाहिए। अगर भोजन को परख प्लेट में स्थानांतरित किया जाता है, तो वह सही डेटा संग्रह में हस्तक्षेप करेगा।
  6. अंतिम धोने के बाद, 100 तक सतह पर तैरने की तैयारी करना81; एम 9 का एल और कृमि गोली बनी हुई है
    सावधानी: 30 मिनट के बाद भुखमरी संबंधित व्यवहार स्पष्ट हो जाते हैं नतीजतन धोने के कदम पूरा हो जाने के बाद एक बार फिर कृत्रिम समाधान से स्थानांतरित किया जाना चाहिए।

2. परख प्लेटों की तैयारी

  1. परख के दो दिन पूर्व मानक एनजीएम अगर प्लेटें तैयार करें।
    1. यदि प्लेटों को आर्द्र वातावरण में रखा जाता है, तो परख से 3 दिन पहले अगर प्लेटें बनाइए। वैकल्पिक रूप से, उचित सूखापन सुनिश्चित करने के लिए 3-6 घंटे के लिए प्लेट के ढक्कन को हटा दें (यदि बाँझ वातावरण में)।
  2. मोटी स्थायी मार्कर के साथ, बाहरी किनारों के साथ थाली के नीचे की तरफ एक पंक्ति बनाते हैं और दूसरा एक मध्य रेखा बाधा ( चित्रा 1 ) बनाने के लिए। प्लेट के प्रत्येक किनारे से मध्य रेखा के अवरोध समान होना चाहिए। सटीक माप सुनिश्चित करने के लिए एक शासक का उपयोग करें। बैक्टीरिया और तांबा समाधान को स्थानांतरित करते समय ये पंक्तियां एक मार्गदर्शिका के रूप में काम करेंगी। उसे उपलब्ध करायाई। कोलाई को तांबे के समाधान से पहले स्थानांतरित कर दिया जाता है, ये लाइनें संकेतक के रूप में काम करती हैं
  3. एक समान लॉन ( चित्रा 2 ) बनाने के लिए तांबा बाधा के केवल एक तरफ ओपी50 ई। कोलाई के 50 μL के साथ बीज प्लेट। बैक्टीरियल एकाग्रता एशेज में लगातार रहना चाहिए; हालांकि, एकाग्रता में हल्के अंतर के जवाब में थोड़ा परिवर्तनशीलता देखी गई है।
    1. प्लेट के नीचे पर चिह्नित लाइनों का उपयोग सुनिश्चित करने के लिए बैक्टीरिया तांबे के समाधान के संपर्क में नहीं आते हैं। बशर्ते कि तांबा समाधान प्लेटों के किनारों के किनारे पर स्थित होता है और एक मध्य रेखा बाधा बनाता है, बैक्टीरिया को हस्तांतरित करता है ताकि तांबे का समाधान खाद्य स्रोत के संपर्क में न आए।
  4. प्लेट्स का दूसरा सेट चिह्नित करें और उन्हें OP50 E. कोलाई को स्थानांतरित करें ( चित्रा 2 )। ये प्लेटें नकारात्मक नियंत्रण का मूल्यांकन करने के लिए काम करेंगे। इन प्लेटों को भी एक होना चाहिएप्रारंभिक स्थानान्तरण मूल को निरूपित करने के लिए प्लेट के एक आधे भाग पर अंकन करना।
  5. बैक्टीरिया सूखने की अनुमति दें तो प्लेटें 37 डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात सेते रहें। सुनिश्चित करें कि 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर या कमरे में स्थानांतरित होने पर बैक्टीरिया के पैच परेशान नहीं होते हैं। अत्यधिक परेशानी भोजन पैच की स्थिति या आकार को बदल सकती है।

3. Chemotaxis परख

  1. प्रारंभिक समय से पहले 0.5 एम तांबा (II) सल्फेट समाधान तैयार करें। बशर्ते समाधान के 125 μL प्रति प्लेट का उपयोग किया जाता है, इस मात्रा का इस्तेमाल परख प्लेटों की संख्या पर निर्भर करता है ( जैसे 5 परख प्लेटें, 625 μL)।
  2. बाहरी तांबा बाधा बनाने के लिए अगर की किनार पर तांबे (II) सल्फेट समाधान के 100 μL पिपेट प्लेट के चिह्नित निचले हिस्से को एक गाइड के रूप में कार्य करना चाहिए।
  3. एक मिडलाइन बाधा बनाने के लिए तांबा (II) सल्फेट समाधान के 25 μL पिपेट
    1. सुनिश्चित करें कि तांबे (II) सल्फेट समाधान करनाजीवाणु पैच के संपर्क में नहीं आते हैं एक सख़्त तकनीक का प्रयोग करें जैसा कि सीधा होने पर आक्रामक / खरोंचों के कारण गतिरोध प्रभावित हो सकता है।
  4. तांबे के समाधान को प्लेट पर सूखने की अनुमति दें प्लेट और लैब स्थितियों के आधार पर समय अवधि भिन्न हो सकती है स्थानान्तरण के बाद प्रत्येक 5 मिनट के दौरान सूखने की जांच करें।
    नोट: तांबे का समाधान नीली रंग की टिंट को प्रदर्शित करता है और आसानी से पहचानता है। सूखापन को समझने के लिए प्लेट के किनारे के पास हल करने के लिए हल्के ढंग से डब करने के लिए प्रयोगशाला के ऊतकों का उपयोग करें ।
  5. परख प्लेट के बैक्टीरिया से मुक्त आधे भाग पर ट्यूब के नीचे कीट की 20 μL पिपेट।
    1. सुनिश्चित करें कि 10 कीड़े परख प्लेट में स्थानांतरित कर रहे हैं यदि अतिरिक्त कीड़े गलती से शामिल हों, तो हलाकार्बन तेल के साथ उठाकर उन्हें हटाने के लिए यह सुनिश्चित करें कि प्लेट में कोई बैक्टीरिया नहीं जोड़ा गया है। परख के दौरान प्रत्येक परख को नेमैटोड्स की लगातार संख्या में होना चाहिए।
      नोट: यदि बहुत कम कीड़े ट्रांसफ़ हैंAssays के दौरान erred, प्रारंभिक नमूना आकार में वृद्धि washes और स्थानान्तरण के दौरान संभावित नुकसान को कम करेगा
  6. एक प्रयोगशाला ऊतक के साथ थाली से अतिरिक्त एम 9 निकालें। एम 9 को तांबा (II) सल्फेट समाधान के संपर्क में नहीं आना चाहिए
    सावधानी: यह कदम सुनिश्चित करते हुए सुनिश्चित करें कि कीड़े और अगर की सतह अप्रभावित रहती है। यदि बहुत कठोर प्रयोग किया जाता है, तो प्रयोगशाला के ऊतक प्लेट की अगर सतह पर इंडेंटेन्ट्स बना सकते हैं और कीड़े हटा सकते हैं। KimWipe द्वारा गलती से हटाए गए कीड़े हटा दिए जाने चाहिए।
  7. एक बार एम 9 समाधान हटा दिया गया और सभी कीड़े ने गैर-तरल लोकोमोटरी पैटर्न शुरू कर दिए हैं, परख स्टॉपवॉच शुरू करें।
    1. बेहतर, एक मिनट में एम 9 समाधान निकालें आवश्यक पैरामीटर sinusoidal गतिरोध की पहचान है वर्म्स लॉकोमोट अलग तरह से, जैसे कि तरल में जब पाइणुसाइड के बजाय थ्रैशिंग होता है। प्रायोगिक अंग में से प्रत्येक के बाद परख रोकना शुरू करेंआईएसएमएस थ्रैशिंग रोकता है
  8. परख प्लेटें हर 30 मिनट की जांच करें
    1. जीवाणु पैच के साथ परख प्लेटों के लिए, सकारात्मक 4 जी अवधि के दौरान भोजन पैच पर पहुंचने के लिए जीवों को सकारात्मक रूप से चलाते हैं। नकारात्मक नियंत्रण प्लेटों के लिए, सकारात्मक रूप से जीवों का स्कोर अगर वे बाधा पार कर गए हैं।

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Representative Results

हमने जंगली प्रकार (एन 2), एनपीआर-9 (टीएम 1652), और एक एनपीआर-9 ओवेरेक्स्पशन स्ट्रेन, यानी एनपीआर-9 (जीएफ) (आईसी 836-एनएपी-9 :: एनएपीआर-9; सुर -5 :: जीएफपी; ओड -1: आरएफपी), भुखमरी और तांबे के घृणा के जवाबों का मूल्यांकन करने के लिए। जंगली प्रकार के जीवों का पता लगाने और उत्पीड़न के तांबा बाधा का जवाब देने में सक्षम हैं, जबकि एनपीआर-9 (जीएफ) म्यूटेंट 4 एच परख 21 से तांबे के उत्पीड़न की प्रतिक्रिया शुरू नहीं करते हैं। भूख से 30 मिनट के बाद, लगभग 50-60% जंगली प्रकार (एन 2) जीव तांबे की बाधा को पार करते हैं और भोजन पैच तक पहुंच जाते हैं। 2 घंटे के निशान पर, 75% जंगली प्रकार के नेमाटोड भोजन स्रोत तक पहुंचते हैं। परख के अंत तक, 100% N2 जीवों को खाद्य स्रोत के लिए स्थानांतरित कर दिया गया है। इसके विपरीत, एनपीआर-9 (जीएफ) के बहुमत वाले भोजन भोजन के जवाब में लोकोमोटरी पैटर्न को विनियमित नहीं करते हैं और भोजन के संपर्क में आने के बाद भी भयावह अवरोध को पार करना जारी रखेंगेस्रोत। 4-एच परख के भोजन की प्रतिक्रिया में एनपीआर -9 (जीएफ) कीड़े लगातार अपने स्थान को बदलने में विफल रहते हैं और केवल 30% परीक्षण जीव किसी भी समय भोजन पर पाए जाते हैं। Npr-9 (एलएफ) जानवरों के साथ-साथ एन 2 जीवों को भी प्रदर्शन नहीं करते हैं, लेकिन भोजन तंत्र ( चित्रा 3 ) तक पहुंचने के लिए भुखमरी बढ़ने के रूप में उनके लोकोमोटरी पैटर्न को विनियमित करते हैं। जब N2 या npr-9 (एलएफ़) जीवों को इस परख के बिना भोजन के मूल्यांकन किया जाता है, तो वे शायद ही कभी तांबा बाधा पार करते हैं। एनपीआर-9 (जीएफ) म्यूटेंट बार-बार बाधाओं को आगे पीछे आगे बढ़ाता है ( चित्रा 4 )।

आकृति 1
चित्रा 1 : 5 सेमी पेट्री डिश के अंडरसाइड पर कॉपर सॉल्यूशन प्लेसमेंट को इंगित करने के लिए चिह्नों का एक दृश्य प्रतिनिधित्व ये संकेत यह सुनिश्चित करने के लिए उपयोग किए जाते हैं किथाली के वर्गों को उचित रूप से मापा गया और बैक्टीरियल पैच को स्थानांतरित करते समय एक दिशानिर्देश के रूप में कार्य किया जाता है और फिर तांबे की तरफ अगर अगर सतह पर होता है इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्र 2
चित्रा 2 चित्रा 2 : 5 सेमी पेट्री डिश को खाद्य परख प्लेट्स को चालू और बंद करने के लिए दो खंडों में विभाजित किया गया है और इन-फूड प्लेट के लिए इन अनुभागों में से एक केंद्र में एक बैक्टीरियल लॉन का गठन किया गया है। भोजन पैच को टेस्ट कंपाउंड के साथ संपर्क में नहीं आना चाहिए जो कि प्लेट के किनारों के किनारों और एक मिडलाइन बाधा होती है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

<P वर्ग = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1"> चित्र तीन
चित्रा 3 : एन 2, एनपीआर-9 (टीएम 1652), और एनपीआर-9 (जीएफ) कीड़े जो कि पोषण-स्थिति के आधार पर कॉपर अचेतन परख के जवाब में चार-चार घंटे की अवधि में खाद्य स्रोत पहुंचते हैं , का प्रतिशत । डेटा अंक कम से कम तीन प्रयोगों (एन> 30 कीड़े) की औसत होती हैं जो दोनों तनावों के लिए अलग-अलग दिनों पर किया जाता है डाटा को औसत ± मानक त्रुटि के रूप में प्रस्तुत किया गया है और दो-दोहराए गए उपायों ANOVA के साथ विश्लेषण किया गया है। ** पी <0.01, समान स्थितियों के तहत एन 2 पशुओं से काफी भिन्न है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 4
चित्रा 4 : एन 2, एनपीआर-9 (टीएम 1652) और एनपीआर-9 (जीएफ) डब्ल्यू ओआरएम की प्रतिशतता जो चार-घंटे की परख के बिना कोई खाद्य स्रोत के साथ कॉपर बैरियर को पार करती है। भोजन के अभाव में तांबे के घृणा के लिए उपरोक्त उपभेदों का मूल्यांकन किया गया। सकारात्मक प्रतिक्रियाओं को तांबा बाधा को पार करने और प्लेट के गैर-मूल आधे हिस्से पर शेष के रूप में रन बनाए जाते हैं। डेटा अंक कम से कम तीन प्रयोगों (एन> 30 कीड़े) की औसत होती हैं जो दोनों तनावों के लिए अलग-अलग दिनों पर किया जाता है डेटा को ± एसई के रूप में प्रस्तुत किया गया है और कम से कम 10 जानवरों को तीन स्वतंत्र प्रयोगों में लगाया गया जो दो-दोहराए गए उपायों एनोवा के साथ विश्लेषण किया गया। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

यह परख डिजाइन एक तांबे समाधान एक aversive मध्य रेखा बाधा और थाली के किनारे के आसपास नेमाटोड का नुकसान को रोकने के लिए बनाने के लिए शामिल करने के लिए भोजन की दौड़ परख 24 संशोधित करता है। ऑर्गेनिज्म को चारवीं पीरियस अवधि के दौरान भोजन के पैच तक पहुंचने की क्षमता के लिए परीक्षण किया जाता है। एनपीआर-9 (जीएफ) के संदर्भ में, हमने इस परख का उपयोग करने के लिए मूल्यांकन किया है कि कैसे भुखमरी की स्थिति भयावह प्रतिक्रियाओं और भोजन की पहचान को प्रभावित कर सकती है बशर्ते कि हमने पहले एनपीआर-9 (जीएफ) को भोजन और व्यर्थ संकेत के प्रति उत्तरदायी होने के लिए दोषपूर्ण बना दिया था, इसलिए हम मूल्यांकन करने के लिए पोषण संबंधी स्थिति के साथ कई गुणों को पर्यावरणीय संकेत देते हैं, यदि भुखमरी दोषपूर्ण एनपीआर 9 (जीएफ) व्यवहार को नियंत्रित कर सकती है। यह परख रासायनिक उत्तेजनाओं और खाद्य संकेतों 3 , 4 का पता लगाने और उसका जवाब देने की कृत्रिम क्षमता पर निर्भर करता है। विभिन्न वैरिएबल्स को देखते हुए, पूर्व की स्थितियांघबराए हुए कारकों को खत्म करने के लिए परिरक्षण जीवों को सावधानीपूर्वक नियंत्रित किया जाना चाहिए। अप्रभावित म्यूटेंट के लिए, अर्थात् अज्ञात व्यभिचारी या भोजन की प्रतिक्रिया के साथ, अतिरिक्त नियंत्रण उपभेदों का उपयोग करने की आवश्यकता होगी अप्रभाविक दोषपूर्ण तनाव, जैसे चे -2 या ओडीआर -3 28 , और म्यूटेंट जो भोजन से स्थानीय प्रथाओं में परिवर्तन नहीं करते हैं, उदाहरण के लिए , टीएफ -1 1 9 को समानांतर में मूल्यांकन किया जाना चाहिए ताकि तांबे और भुखमरी की स्थिति को उचित रूप से नियंत्रित किया जा सके। इसके अलावा, मूल्यांकन किए गए व्यवहार के लिए भुखमरी के योगदान को और अधिक प्रत्यक्ष रूप से उजागर करने के लिए, अतिरिक्त नियंत्रणों के लिए पृथक परख की स्थिति भी विकसित की जा सकती है। उदाहरण के लिए, नेमाटोड को परख के तुरंत पहले भूखा किया जा सकता है और यह पता लगाया जा सकता है कि भूख की स्थिति में एक जीवित तांबा को कितनी जल्दी प्रतिक्रिया देगा और खाना पैच तक पहुंचने के लिए कितनी तेजी से यह पता लगाने के लिए परख प्लेट (भोजन के साथ) को स्थानांतरित किया जा सकता है। हमारे वर्तमान परख avप्रामाणिक जीवों के रूप में अच्छी प्रतिक्रियाएं एक अच्छी तरह से तंग आकर भूखे राज्य से प्रगति की।

हमारी परख आम तौर पर इस्तेमाल किया जाने वाला सी। एलिगेंस कीमोटेक्सिस परख 4 का एक संशोधन है जिसमें अधिक विस्तारित समय अवधि में व्यवहार का मूल्यांकन करने के लिए एक मजबूत उत्तेजना ( यानी उच्च एकाग्रता) शामिल किया गया है। तात्कालिक प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के बजाय, इस परख का उपयोग व्युत्क्रम प्रतिक्रियाओं में परिवर्तन को मापने के लिए किया जा सकता है क्योंकि जीवों की भूख की स्थिति में प्रगति की जा रही है (यदि आवश्यक नियंत्रण शामिल हैं)। इसी प्रकार के मूल्यांकन के समय 24 से अधिक है, ताकि इथेनॉल वापसी प्रतिक्रियाओं, यानी भोजन लगाने नेमाटोड का मूल्यांकन करने में तांबे के अभाव में इस्तेमाल किया गया है।

जैसा कि सी में किसी भी व्यवहार परख के साथ मामला है । एलिगेंस, पर्यावरण चर के लिए नियंत्रण लगातार पुन: उत्पादक परिणाम सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। जीवों को सभी समान होना चाहिएई, यह देखते हुए कि व्यवहार प्रतिक्रियाएं उम्र के साथ भिन्न हो सकती हैं इसके अलावा, कीड़े के पोषण संबंधी स्थिति में परिवर्तनशीलता भुखमरी की स्थितियों में तेजी ला सकती है। इसलिए, इस प्रोटोकॉल से पहले किसी भी समय प्रायोगिक कीड़ों को भुखमरी नहीं लेनी चाहिए। अभिभावक पीढ़ी का भुखमरी अनुभव भी संतान व्यवहार 30 को प्रभावित कर सकता है; इसलिए, यह सुनिश्चित करना उचित है कि प्रायोगिक जीव कम से कम दो पीढ़ियों के लिए अच्छी तरह से खिलाए जाते हैं। इसके अलावा, परख प्लेटों को स्थानांतरित किए गए जीवों की संख्या लगातार दी जानी चाहिए ताकि स्थानीय आबादी घनत्व फैलाने की दर 31 को प्रभावित कर सके। एक बार कीड़े को प्लेट्स में स्थानांतरित कर दिया जाता है, तो यह किार की सतह को क्षतिग्रस्त किए बिना प्रयोगशाला के ऊतकों के साथ अतिरिक्त एम 9 समाधान को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। सतह में परिवर्तन सहज-गतिशील पैटर्न के साथ हस्तक्षेप कर सकती है। आधिकारिक शुरुआत की शुरुआत से पहले अतिरिक्त समाधान को उचित रूप से हटा दिया जाना चाहिएयह सुनिश्चित करने के लिए परख है कि पिटाई करने का व्यवहार, अर्थात् तरल पदार्थ में मनाया गया नीमेटोड लोकोमोटरी पैटर्न, मौजूद नहीं है। एक स्पष्ट संकेतक क्रॉलिंग व्यवहार की तलाश करना है।

परख प्लेटें नियंत्रित की जानी चाहिए ताकि प्लेट और जीवाणु सूख सुसंगत हो। Overly ताजा प्लेटों locomotory दोष उत्पन्न कर सकते हैं और यह भी पर्यावरण उत्तेजनाओं 6 का पता लगाने के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। तांबे के समाधान के आवेदन को यथासंभव संगत होना चाहिए ताकि उत्पीड़न बाधा उचित रूप से मोटे हो जाएं और वे भोजन स्रोत के संपर्क में नहीं आते हैं। बहुत कम तांबे के समाधान को लागू करने से जंगली प्रकार के व्यभिचारी प्रतिक्रिया समय कम हो सकता है, जबकि बहुत ज्यादा नेमेटोड्स को घातक साबित हो सकता है। तांबे के समाधान के लिए एक समान मोटाई के लक्ष्य के लिए सर्वोत्तम परिणाम उत्पन्न होते हैं। अगर कॉपर समाधान आवेदन के दौरान अगर में बने होते हैं तो परख प्लेट को छोड़ देना चाहिए। इस तरह के छेद के माध्यम से कीड़े 32 में घुमा सकते हैं, विशेष रूप से जब एक उत्पीड़न पदार्थ या भुखमरी के साथ सामना किया। नमूनों में प्लेट एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, कृमि के मिश्रित आबादी ( अर्थात् उत्परिवर्ती और जंगली प्रकार) को एक ही प्लेट पर मापा जा सकता है अगर एक विशिष्ट रूप से लेबल किया गया हो ( जैसे जीएफपी के माध्यम से )।

हालांकि यह परख मानक आकार के अगर प्लेटों पर किया गया था, हालांकि बड़े प्लेटों का उपयोग किया जा सकता है ( जैसे 100 मिमी व्यास)। इस परिदृश्य में, परख अवधि 6 घंटे तक बढ़ाई जानी चाहिए ताकि कृमि आंदोलन के लिए पर्याप्त समय प्रदान किया जा सके। बड़ी प्लेटें बड़ी आबादी के परीक्षण के लिए अनुमति दे सकती हैं और यह जांचने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि जनसंख्या घनत्व समय की विस्तारित अवधि में प्रतिकूल प्रतिक्रियाओं को कैसे प्रभावित करती है। अधिक तकनीकी रूप से उन्नत प्रक्रियाओं को एक जंगम चरण 33 के साथ कृमि ट्रैकिंग उपकरणों के उपयोग के साथ भी शामिल किया जा सकता है। कृमि ट्रैकिंग से अधिक सटीक माप की अनुमति होगी और अतिरिक्त चर के संग्रह ( जैसे

परख आसानी से वैकल्पिक फ़िनोटाइप के माप के लिए अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। आयु से संबंधित भुखमरी प्रेरित प्रेरित परिवर्तनों पर माप की अनुमति देने के लिए कीड़ा की आयु भिन्न हो सकती है। इसके अलावा, प्रयोगात्मक कीड़े के पोषण संबंधी स्थिति में बदलाव भोजन और रासायनिक घृणा के संदर्भ में भूख के आदी होने के विश्लेषण के लिए भी अनुमति दे सकते हैं। जब तक प्रोटोकॉल तुलनीय डेटा सेट के अनुरूप होते हैं, तब तक प्रायोगिक जीवों की लगभग किसी भी पूर्व-कंडीशनिंग को कैमोटैक्सिस परख के माध्यम से मूल्यांकन किया जा सकता है।

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Disclosures

हमारे पास खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है

Acknowledgments

यह काम विलियम जी। बेंडिना के लिए प्राकृतिक विज्ञान और कनाडा रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा डिस्कवरी ग्रांट आरजीपीआईएन 36481-08 द्वारा समर्थित था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] Produced in lab
Cupric Sulfate Sigma C-1297 Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M

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तंत्रिका जीव विज्ञान अंक 125, रसायनकरण तांबा भुखमरी घृणा रसायनता भोजन
ए<em&gt; कैनोरहाब्लाइटिस एलिगेंस</em&gt; पोषण-स्थिति आधार पर कॉपर अचेतन परख
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Campbell, J. C., Chin-Sang, I. D., Bendena, W. G. A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay. J. Vis. Exp. (125), e55939, doi:10.3791/55939 (2017).

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