Summary
Hier präsentieren wir einen Caenorhabditis-Elegans- spezifischen Assay, der dazu bestimmt ist, Veränderungen des Kupfer-Aversionsverhaltens und die Fähigkeit, eine gemeinsame Nahrungsquelle zu lokalisieren, zu bewerten, da der Organismus von einem gut gefütterten bis hin zu verhungertem Ernährungszustand fortschreitet.
Abstract
Um das Überleben zu sichern, müssen die Organismen in der Lage sein, ungünstige Lebensräume zu vermeiden und gleichzeitig eine gleichbleibende Nahrungsquelle zu gewährleisten. Caenorhabditis elegans verändern ihre Lokomotionsmuster bei der Erkennung diverser Umwelteinflüsse und können ihre Abhängigkeit von Verhaltensreaktionen als Reaktion auf Hungerbedingungen modulieren. Nematoden zeigen typischerweise eine verringerte aversive Antwort, wenn sie aus einer Nahrungsmittelquelle für mehr als 30 min entfernt werden. Die Beobachtung von Verhaltensänderungen in Reaktion auf einen sich ändernden Ernährungsstatus kann Einblick in die Mechanismen geben, die den Übergang von einem gut gefütterten in den verhungerten Zustand regeln.
Wir haben einen Assay entwickelt, der die Fähigkeit eines Nematoden misst, eine aversive Barriere ( dh Kupfer) zu überqueren und dann über einen längeren Zeitraum eine Nahrungsquelle zu erreichen. Dieses Protokoll baut auf früheren Arbeiten auf, indem es mehrere Variablen in einer Weise integriert, die eine fortlaufende Datenerfassung ermöglicht, während sich die Organismen zu einemN zunehmend verhungert. Darüber hinaus erlaubt dieser Assay eine erhöhte Probengröße, so dass größere Populationen von Nematoden gleichzeitig ausgewertet werden können.
Organismen, die für die Fähigkeit, Kupfer zu erkennen oder zu reagieren, sofort die chemische Barriere kreuzen, während Wildtyp-Nematoden anfänglich abgestoßen werden. Da Wildtyp-Würmer zunehmend verhungert sind, beginnen sie, die Barriere zu überqueren und die Nahrungsquelle zu erreichen. Wir haben diesen Assay entworfen, um eine Mutante zu bewerten, die nicht in der Lage ist, auf verschiedene Umwelt-Cues zu reagieren, einschließlich der Nahrungsmittelempfindung oder des Nachweises von aversiven Chemikalien. Wenn sie über dieses Protokoll ausgewertet wurden, überquerten die defekten Organismen sofort die Barriere, waren aber auch nicht in der Lage, eine Nahrungsmittelquelle zu detektieren. Daher kreuzen diese Mutanten wiederholt die chemische Barriere, obwohl sie vorübergehend eine Nahrungsquelle erreichen. Dieser Assay kann einfach die Populationen von Würmern testen, um mögliche Wegdefekte im Zusammenhang mit Abneigung und Hunger zu bewerten.
Introduction
Caenorhabditis elegans wurde als Modell für das Studium der Neurobiologie seit Jahrzehnten aufgrund der relativen Leichtigkeit bei der Analyse der Schaltungen eines Nervensystems aus nur 302 Neuronen 1 verwendet . Vorausgesetzt, dass der Organismus auf die Reaktion auf Umwelt-Cues angewiesen ist, ist ein Großteil des Nervensystems der Regulierung der Integration von Umweltsignalen gewidmet 2 . Trotz der Einfachheit seines Nervensystems kann C. elegans verschiedene Umweltsignale erkennen und darauf reagieren, einschließlich Repellents 3 , Lockstoffe 4 , Temperatur 5 und sogar Feuchtigkeit 6 . Ein nicht ordnungsgemäß Umweltsignale integrieren hat zu einer Reihe von Verhaltensstörungen und neurodegenerativen Erkrankungen in Säugern Modellsystemen 7- 9 verbunden. Mit einer Reihe von verfügbaren neuralen Krankheit Modelle 10 in C. elegans und die Entwicklung von Nematoden-Pharma-Bildschirmen 11 hat sich dieser Organismus als ein nützliches System für das Studium der Neurobiologie erwiesen. Angesichts der Verfügbarkeit eines abgebildeten Nematoden-Verbundes 1 und Mutationen für fast jedes Gen im Nematoden-Genom 12 ist unser Verständnis des Nematoden-Nervensystems und durch die Erweiterung unserer eigenen teilweise durch die Gestaltung von kreativ geeigneten Assays begrenzt.
Eine Reihe von Chemotaxis-Assays wurden in den letzten 40 Jahren entwickelt, um die Nematoden-Ansprechempfindlichkeit auf verschiedene aversive Stimuli 3 , 4 , 13 , 14 , 15 zu bewerten. Initiale Experimente waren die Einführung eines akuten Umwelteinflusses, während ein einziger Wurm auf einer Agarplatte durchstreifte= "Xref"> 3 , 14 , 16 . Sofortige Änderungen der Lokomotionsreaktionen wurden aufgezeichnet. Zum Beispiel kann der flüchtige Geruchsstoff Octanol auf ein Haar aufgetragen werden und vor einem Nematoden der Nase geweht 17 die Einleitung rückwärts Fortbewegung in Wildtyp - Würmern zu stimulieren. Komplexere Assays wurden auch entwickelt, um mehrere Variablen als Mittel zur Bewertung der Verhaltensauswahl zu integrieren 18 . Eine Variation dieses Assays beinhaltet die Verwendung einer Kupferlösung, um eine aversive Mittellinienbarriere 4 zu erzeugen. Ein Lockmittel, nämlich Diacetyl, wurde auf einer Seite der chemischen Barriere mit Würmern, die von der Diacetylquelle weg übertragen wurden, platziert. Würmer defekt für Kupfer aversive Reaktionen sofort über die Barriere, um das Diacetyl zu erreichen, während Wildtyp-Würmer wurden zunächst von der Barriere abgelehnt. Responses wurden erzielt, als Würmer zuerst die Kupferbarriere nähertenOhne langfristige Beobachtungen.
Wenn Würmer ausgewertet werden nach Hungerbedingungen unterzogen, ihre Empfindlichkeit auf Umweltreize 19 verringert. Wenn das aversive chemische Octanol vor der Nematoden-Nase geweht wird, stimulieren Wildtyp-Organismen die Rückwärtsbewegung innerhalb von 3 - 5 s, wenn sie auf Nahrung sind. Nachdem diese Organismen 10 Minuten aus der Nahrung entfernt worden sind, zeigen sie eine verzögerte Reaktion von 8 - 10 s 20 . So zeigen Nematoden mit erhöhtem Hunger eine verminderte aversive Reaktion auf schädliche Umweltsignale, da die Suche nach Nahrung für das Überleben wesentlich wird. Umgekehrt reagieren Nematoden, die den Neuropeptidrezeptor 9 ( npr-9) überexprimieren , nicht auf Octanol auf oder aus der Nahrung und zeigen eine Unfähigkeit, auf eine Anzahl von aversiven Reizen zu reagieren 21 . Diese npr-9 (GF) -Organismen modulieren auch nicht ihre Umkehrfrequenz in Gegenwart von Nahrung, sondern könnenUmgekehrt als Reaktion auf harte Berührungsstimulationen, die darauf hinweisen, dass sie in der Lage sind, Rückwärts-Fortbewegung 21 zu machen . Wir haben auch npr-9 (LF) -Mutanten ausgewertet, da sie eine ungewöhnlich verminderte Umkehrfrequenz aus der Nahrung aufweisen und dennoch ihr Verhalten in Gegenwart von Nahrung modulieren können 21 . Die Kopplung des Ernährungszustandes des Wurms mit der Einführung akuter externer Reize hat bei der Aufklärung der Mechanismen unterstützt, mit denen ein lebensmittelbezogener Weg die sensorischen Signalwege 22 , 23 weitgehend modulieren kann. Die Anwesenheit von Speisen in der Nematodenumgebung wurde auch verwendet, um Ethanol-Entzugsantworten zu bewerten 24 . In diesem Experiment wurden die Würmer in unterschiedlichen Konzentrationen von Ethanol inkubiert und dann auf eine Agarplatte mit einem Nahrungsmittelfleck, das als "Food-Race Assay" bekannt war, platziert. Der Nahrungsmittelfleck wurde auf eine Kante der Platte gelegt, während die Nematoden wVon der Nahrungsquelle entfernt. Der Ethanolentzug wurde durch Messung der Zeitdauer gemessen, die für die Würmer benötigt wurde, um den Lebensmittelfleck zu erreichen.
Dieser Nährstoff-basierte Kupfer-Aversion-Assay baut auf dem Food-Race-Assay auf, um zusätzliche Umgebungsvariablen, nämlich Nahrung und Kupfer, zu integrieren und dabei Verhaltensänderungen im Laufe der Zeit zu bewerten. Dies ist eine Anpassung eines gemeinnützigen Protokolls in der gesamten C. elegans- Gemeinschaft 4 . Dieses Protokoll wurde verwendet, um aversive Reaktionen und die Erkennung von Lebensmitteln über einen Zeitraum von vier Stunden zu bewerten 21 . Da die Wurmaussetzveranstaltungen nach 30 min Nahrungsdeprivation 25 zeigen , können wir auch beurteilen, wie sich Veränderungen des Ernährungszustands auf Umweltreaktionen auswirken können. Die Bedingungen dieses Assays messen, wie experimentelle Organismen die Reaktionsfähigkeit auf aversive Stimuli im Laufe der Zeit verändern und damit Verhaltensänderungen bewertenOrganismen Fortschritte in Richtung eines ausgehungerten Zustandes (und fortgesetzte Messungen des verlängerten Hungers). Da die npr-9 (GF) Tiere ihr Verhalten nicht als Reaktion auf Nahrung oder viele aversive Cues verändern, haben wir versucht zu erkennen, ob diese Verhaltensdefizite im Kontext des Hungers bestehen würden. Letztlich wurde dieses Assay-Design formuliert, um die npr-9 (GF) -Mutanten spezifisch zu bewerten, sondern kann auch angepasst werden, um auch neue Stämme zu charakterisieren.
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Protocol
1. Vorbereitung von experimentellen Organismen
- Wählen Sie 10 L4 inszenierte Nematoden pro Stamm 24 h vor Beginn des Assays, um sicherzustellen, dass Organismen junge Erwachsene sind, wenn sie getestet werden. Für jede Mutante oder Kontroll-Nematode getestet, wählen Sie 10 L4s (10 für die Kontrolle und 10 für den Assay).
- Halten Sie L4-Organismen unter Verwendung der Standardmethoden 26 , 27 für 24 h auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coli seediert wurden. Wenn Organismen während der nachfolgenden Waschschritte verloren gehen, kompensieren Sie durch Erhöhung der Startprobengröße ( dh 20 Würmer anstatt 10).
Anmerkung: Verhalten ist ein innig variabler Phänotyp. Führen Sie die Methode in dreifacher Ausfertigung für jede Belastung an drei getrennten Tagen durch. Fügen Sie zusätzliche Kontrollstämme und Bedingungen für neuartige Stämme ein, wie im Diskussionsbereich hervorgehoben.
- Halten Sie L4-Organismen unter Verwendung der Standardmethoden 26 , 27 für 24 h auf Standard-Agarplatten, die mit OP50 Escherichia coli seediert wurden. Wenn Organismen während der nachfolgenden Waschschritte verloren gehen, kompensieren Sie durch Erhöhung der Startprobengröße ( dh 20 Würmer anstatt 10).
- Unmittelbar vor dem Test, Transfer experimentelle OrgaNismen zu einer Agarplatte ohne Bakterien und erlauben Nematoden, sich frei für 1 min zu bewegen, um überschüssige Bakterien zu entfernen.
- Wenn experimentelle Organismen während des 24 h vor dem Assay Kontamination Bedingungen erlebt haben, verwerfen sie.
- 1 ml M9 auf die bakterienfreie Platte pipettieren, um die Würmer in ein Mikrozentrifugenröhrchen zu waschen.
- Zentrifuge bei 3.000 xg für 1 min. Würmer sollten ein Pellet an der Unterseite des Rohres bilden. Aspirieren Sie die M9-Lösung, ohne das Wurmpellet zu stören. Füge 1 ml M9 zum Wurm-Pellet hinzu, umschleife die Röhrchen mit der Lösung.
- Wiederholen Sie Schritte 1.4 drei weitere Male.
- Wenn überschüssige Bakterien zunächst mit den Würmern transferiert wurden, wiederholen Sie sich für insgesamt 5 mal. Keine Bakterien sollten auf die Kupfer-Food-Race-Platten übertragen werden. Wenn das Essen auf die Testplatte übertragen wird, wird es eine genaue Datenerfassung beeinträchtigen.
- Nach der letzten Wäsche, Absaugen Überstand bis 10081, L von M9 und das Wurmpellet bleibt.
Achtung: Verhungernde Verhaltensweisen werden nach 30 min deutlich. Folglich sollten die Würmer sofort aus der Lösung übertragen werden, sobald die Waschschritte abgeschlossen sind.
2. Vorbereitung von Testplatten
- Vorbereiten der Standard-NGM-Agarplatten zwei Tage vor dem Assay.
- Wenn die Platten in einer feuchten Umgebung gehalten werden, machen Agarplatten 3 Tage vor dem Test. Alternativ entfernen Sie den Deckel der Platte für 3 - 6 Stunden, um eine ordnungsgemäße Trockenheit zu gewährleisten (wenn in einer sterilen Umgebung).
- Mit einem dicken Permanentmarker eine Linie auf der Unterseite der Platte entlang der äußeren Kante und eine andere, um eine Mittellinie Barriere ( Abbildung 1 ) zu bilden. Die Mittellinienbarriere sollte von jeder Kante der Platte gleich weit entfernt sein. Verwenden Sie ein Lineal, um genaue Messungen zu gewährleisten. Diese Linien dienen als Leitfaden bei der Übertragung von Bakterien und der Kupferlösung. Unter der Vorraussetzung, dassE. coli wird vor der Kupferlösung übertragen, diese Zeilen dienen als Indikatoren.
- Samenplatte mit 50 μl OP50 E. coli auf nur einer Seite der Kupferbarriere, um einen gleichmäßigen Rasen zu schaffen ( Abbildung 2 ). Die Bakterienkonzentration sollte über die Assays hinweg konsistent bleiben; Jedoch wurde eine kleine Variabilität in Reaktion auf leichte Konzentrationsunterschiede beobachtet.
- Benutze die markierten Linien auf der Unterseite der Platte, um sicherzustellen, dass die Bakterien nicht mit der Kupferlösung in Berührung kommen. Vorausgesetzt, dass die Kupferlösung den Rand der Platte bildet und eine Mittelliniensperre bildet, übertragen die Bakterien, so dass die Kupferlösung nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommt.
- Markieren Sie einen zweiten Satz von Platten und übertragen Sie keine OP50 E. coli zu ihnen ( Abbildung 2 ). Diese Platten dienen zur Bewertung der Negativkontrolle. Diese Platten sollten auch eineMarkierung auf einer Hälfte der Platte, um den ursprünglichen Transferursprung zu bezeichnen.
- Bakterien trocknen lassen, dann die Platten bei 37 ° C über Nacht inkubieren. Sicherstellen, dass bakterielle Flecken bei der Übertragung auf einen 37 ° C Inkubator oder Raum nicht gestört werden. Übermäßige Störung könnte die Lage oder Form des Nahrungsmittelflecks verändern.
3. Chemotaxis-Assay
- Frisch eine 0,5 M Kupfer (II) sulfatlösung vor der Teststartzeit vorbereiten. Sofern 125 μl der Lösung pro Platte verwendet werden, wird dieses Volumen abhängig von der Anzahl der verwendeten Testplatten ( z. B. 5 Testplatten, 625 μL) skaliert.
- 100 μl der Kupfer (II) sulfatlösung am Rand des Agars pipettieren, um eine äußere Kupferbarriere zu erzeugen. Die markierte Unterseite der Platte sollte als Leitfaden dienen.
- 25 μl der Kupfer (II) sulfatlösung pipettieren, um eine Mittellinienbarriere zu erzeugen.
- Stellen Sie sicher, dass sich die Kupfer (II) sulfatlösung ergibtEs kommt nicht mit dem Bakterienfleck in Berührung. Verwenden Sie eine gefleckte Technik als Streifen kann die Fortbewegung aufgrund von Einbuchtungen / Kratzer auf dem Agar beeinflussen.
- Lassen Sie die Kupferlösung auf die Platte trocknen. Der Zeitraum kann je nach Platten- und Laborbedingungen variieren. Überprüfen Sie alle 5 Minuten nach der Übertragung auf Trockenheit.
Anmerkung: Die Kupferlösung zeigt eine blaue Tönung und ist leicht zu identifizieren. Verwenden Sie ein Laborgewebe, um die Lösung in der Nähe des Randes der Platte leicht zu tupfen, um die Trockenheit zu erkennen . - 20 μl des Wurmpellets vom Boden des Röhrchens auf die bakterienfreie Hälfte der Testplatte pipettieren.
- Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich eingeschlossen waren, entfernen Sie sie, indem Sie mit Halogenkohlenstofföl pflücken, um sicherzustellen, dass keine Bakterien der Platte hinzugefügt werden. Jeder Assay sollte eine konsistente Anzahl von Nematoden während des Assays haben.
HINWEIS: Wenn zu wenige Würmer transf sindFehlerhaft während der Assays, die Erhöhung der anfänglichen Stichprobengröße wird potenzielle Verluste während der Waschungen und Transfers abschwächen.
- Stellen Sie sicher, dass 10 Würmer auf die Testplatte übertragen werden. Wenn zusätzliche Würmer versehentlich eingeschlossen waren, entfernen Sie sie, indem Sie mit Halogenkohlenstofföl pflücken, um sicherzustellen, dass keine Bakterien der Platte hinzugefügt werden. Jeder Assay sollte eine konsistente Anzahl von Nematoden während des Assays haben.
- Entfernen Sie überschüssiges M9 aus der Platte mit einem Laborgewebe. M9 sollte nicht mit der Kupfer (II) sulfatlösung in Berührung kommen.
Achtung: Sicherstellen, dass die Würmer und die Agaroberfläche bei dieser Ausführung unberührt bleiben. Wenn es zu hart verwendet wird, kann das Laborgewebe Vertiefungen auf die Agaroberfläche der Platte erzeugen und Würmer entfernen. Würmer, die zufällig über KimWipe entfernt wurden, sollten verworfen werden. - Sobald die M9-Lösung entfernt wurde und alle Würmer mit nicht-flüssigen Lokomotionsmustern begonnen haben, starten Sie die Teststoppuhr.
- Optimal entfernen Sie die M9-Lösung innerhalb eines min. Der wesentliche Parameter ist die Identifizierung der sinusförmigen Fortbewegung. Würmer locomote anders, z. B. Thrash anstatt sinusförmig, wenn in Flüssigkeit. Starten Sie die Assay Stoppuhr einmal jedes der experimentellen OrgelIsms hört auf zu schlagen
- Überprüfen Sie alle 30 min.
- Für die Assay-Platten mit bakteriellen Patches, positiv Score-Organismen, wenn sie die Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden erreichen. Für die negativen Kontrollplatten, positiv Kerbe Organismen, wenn sie die Barriere überschritten haben.
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Representative Results
Wir nutzten Wildtyp (N2), npr-9 (tm1652) und einen npr-9- Überexpressionsstamm, dh npr-9 (GF) (IC836 - npr-9 :: npr-9; sur-5 :: gfp; odr -1 :: rfp), um Antworten auf Hunger und Kupferabwehr zu bewerten. Wildtyp-Organismen sind in der Lage, die aversive Kupferbarriere zu detektieren und zu reagieren, während npr-9 (GF) -Mutanten keine aversive Antwort auf das Kupfer über den 4 h-Assay 21 auslösen. Nach 30 min Verhungern überqueren etwa 50 - 60% der Wildtyp (N2) -Organismen die Kupferbarriere und erreichen das Nahrungsmittelpflaster. Bei der 2-h-Marke erreichen 75% der Wildtyp-Nematoden die Nahrungsquelle. Am Ende des Assays sind 100% der N2-Organismen in die Nahrungsquelle verlagert. Im Gegensatz dazu moduliert die Mehrheit der npr-9 (GF) -Organismen keine Lokomotionsmuster als Reaktion auf die Nahrung und wird auch weiterhin die aversive Barriere überqueren, auch wenn sie mit einer Nahrung in Berührung kommenQuelle. Die npr-9 (GF) -Würmer können ihre Fortbewegung in Reaktion auf Nahrung über den 4-h-Test ununterbrochen verändern und nur 30% der Testorganismen werden zu jeder Zeit auf dem Essen gefunden. Die npr-9 (LF) -Tiere führen nicht so gut wie N2-Organismen durch, sondern modulieren ihre Lokomotionsmuster, wenn der Hunger zunimmt, um den Nahrungsmittelflecken zu erreichen ( Abbildung 3 ). Wenn N2- oder npr-9 (LF) -Organismen über diesen Assay ohne Nahrung ausgewertet werden, überqueren sie selten die Kupferbarriere. Die npr-9 (GF) -Mutanten kreuzen wiederholt die Barriere hin und her ( Abbildung 4 ).
Abbildung 1 : Eine visuelle Darstellung von Markierungen, um eine Kupferlösungs-Platzierung auf der Unterseite eines 5-cm-Petrischalens anzuzeigen. Diese Indikationen werden verwendet, um sicherzustellen, dassDie Abschnitte der Platte wurden entsprechend gemessen und dienen als Leitlinie bei der Übertragung des Bakterienflecks und dann der Kupferlösung auf die Agaroberfläche. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Der 5-cm-Petrischale wird in zwei Abschnitte für Ein-und Aus-Food-Assay-Platten aufgeteilt und ein Bakterien-Rasen wird in der Mitte eines dieser Sektionen für die On-Food-Platte geformt. Der Nahrungsmittelfleck sollte nicht mit der Testverbindung in Berührung kommen, die die Kanten der Platte leitet und eine Mittellinienbarriere bildet. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Prozentsatz von N2, npr-9 (tm1652) und npr-9 (GF) Würmer, die die Nahrungsquelle über einen Zeitraum von vier Stunden in Reaktion auf den auf Nahrungsstatus basierenden Kupfer-Aversion-Assay erreichen. Datenpunkte sind Mittelwerte von mindestens drei Experimenten (n> 30 Würmer), die an getrennten Tagen für beide Stämme durchgeführt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardfehler dargestellt und mit einer zweifachen wiederholten Maßnahme ANOVA analysiert. ** p <0,01, signifikant verschieden von N2-Tieren unter identischen Bedingungen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : Prozentsatz von N2, npr-9 (tm1652) und npr-9 (GF) W ormen, die die Kupferbarriere ohne Nahrungsquelle über einen vierstündigen Assay kreuzen. Die vorgenannten Stämme wurden hinsichtlich der Kupferabwehr in Abwesenheit von Nahrungsmitteln bewertet. Positive Reaktionen werden als Kreuzung der Kupferbarriere bewertet und verbleiben auf der Nicht-Ursprung-Hälfte der Platte. Datenpunkte sind Mittelwerte von mindestens drei Experimenten (n> 30 Würmer), die an getrennten Tagen für beide Stämme durchgeführt wurden. Die Daten werden als Mittelwert ± SE dargestellt und mindestens 10 Tiere wurden in drei unabhängigen Experimenten untersucht, die mit einem Zwei-Wege-wiederholten Maßnahmen ANOVA analysiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Diese Assay-Konstruktion modifiziert den Nahrungsmittel-Race-Assay 24 , um eine Kupferlösung zu umfassen, um eine aversive Mittellinien-Barriere und um den Rand der Platte zu schaffen, um einen Verlust von Nematoden zu verhindern. Organismen sind auf ihre Fähigkeit, die aversive Barriere zu überqueren und erreichen ein Lebensmittel-Patch über einen Zeitraum von 4 Stunden getestet. Im Kontext von npr-9 (GF) haben wir diesen Assay verwendet, um zu bewerten, wie Hungerbedingungen aversive Reaktionen und den Nachweis von Nahrung beeinflussen könnten. Vorausgesetzt, dass wir zuvor npr-9 (GF) als fehlerhaft für die Reaktionsfähigkeit auf Nahrung und aversive Cues charakterisiert hatten , kombinierten wir Multiples Umweltzeichen mit Ernährungsstatus, um zu bewerten, ob Hunger das defekte npr-9 (GF) -Verfahren modulieren könnte. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit eines Wurms, chemische Reize und Lebensmittel-Cues 3 , 4 zu erkennen und zu reagieren. Angesichts der verschiedenen analysierten Variablen wurden die Bedingungen der ExPerimentalorganismen müssen sorgfältig kontrolliert werden, um verwirrende Faktoren zu beseitigen. Für nicht charakterisierte Mutanten, dh solche mit unbekannter aversiver oder Nahrungsmittelreaktion, müssten zusätzliche Kontrollstämme verwendet werden. Aversive Defektstämme, z. B. Che-2 oder Odr-3 28 , und Mutanten, die keine Lokomotionsmuster aus der Nahrung, z. B. tph-1 29 , verändern, sollten auch parallel ausgewertet werden, um sicherzustellen, dass die Kupfer- und Hungerbedingungen entsprechend kontrolliert werden. Darüber hinaus können, um den Beitrag des Hungers auf das ausgewertete Verhalten direkt hervorzuheben, auch separate Testbedingungen für zusätzliche Kontrollen entwickelt werden. Zum Beispiel können die Nematoden unmittelbar vor dem Assay verhungert und auf die Testplatte (mit Nahrung) übertragen werden, um zu ermitteln, wie schnell ein Organismus in einem ausgehungerten Zustand auf Kupfer reagiert und den Nahrungsmittelflecken erreicht. Unsere aktuellen Test-Highlights avErsive Reaktionen, da die experimentellen Organismen von einem gut gefütterten in den verhungerten Staat fortschreiten.
Unser Assay ist eine Modifikation des häufig verwendeten C. elegans- Chemotaxis-Assays 4, bei dem ein stärkerer Stimulus ( dh hohe Konzentration) aufgenommen wurde, um Verhaltensweisen über einen längeren Zeitraum zu bewerten. Anstatt die momentanen Reaktionen zu bewerten, kann dieser Assay verwendet werden, um Veränderungen in aversiven Reaktionen zu messen, da Organismen in Richtung eines ausgehungerten Zustands fortschreiten (falls die notwendigen Kontrollen enthalten sind). Ähnliche Auswertungen in Abwesenheit von Kupfer zu bewerten , um Ethanolentzug Antworten, dh Nematoden Ortung Essen, im Laufe der Zeit wurden 24 verwendet.
Wie bei jedem Verhaltenstest bei C. elegans ist die Kontrolle von Umgebungsvariablen für die Sicherstellung konsequent reproduzierbarer Ergebnisse unerlässlich. Organismen müssen alle gleich seinE, da die Verhaltensreaktionen mit dem Alter variieren können. Darüber hinaus kann die Variabilität des Ernährungszustandes der Würmer die Akklimatisierung der Hungerbedingungen verändern. Daher sollten die experimentellen Würmer nicht an irgendeinem Punkt vor diesem Protokoll verhungern. Hungersnot Erfahrung der elterlichen Generation kann auch beeinflussen Nachkommen Verhalten 30 ; Daher ist es ratsam, dafür zu sorgen, dass die experimentellen Organismen für mindestens zwei Generationen gut gefüttert werden. Darüber hinaus sollte die Anzahl der auf die Testplatten übertragenen Organismen konsistent bleiben, da die lokale Bevölkerungsdichte die Ausbreitungsraten beeinflussen kann 31 . Sobald Würmer auf die Platten übertragen worden sind, ist es entscheidend, die überschüssige M9-Lösung mit einem Laborgewebe zu entfernen, ohne die Agaroberfläche zu beschädigen. Eine Veränderung der Oberfläche kann mit spontanen Lokomotikmustern interferieren. Die überschüssige Lösung muss vor dem Beginn des offiziellen Startvorgangs entsprechend entfernt werdenDer Assay, um sicherzustellen, dass ein Thrashing-Verhalten, dh ein Nematoden-Lokomotixmuster, das in der Flüssigkeit beobachtet wird, nicht vorhanden ist. Ein klarer Indikator ist, nach dem Kriechverhalten zu suchen.
Die Testplatten müssen so kontrolliert werden, dass die Platte und die bakterielle Trockenheit konsistent sind. Übermäßig frische Platten können Lokomotionsdefekte verursachen und können auch den Nachweis von Umwelteinflüssen beeinträchtigen 6 . Die Anwendung der Kupferlösungen muss so konsistent wie möglich sein, so dass aversive Barrieren in geeigneter Weise dick sind und sie nicht mit der Nahrungsquelle in Berührung kommen. Die Anwendung zu wenig Kupferlösung könnte die wilde Art aversive Reaktionszeit vermindern, während zu viel die Trommeln für die Nematoden beweisen könnte. Das Zielen auf eine gleichmäßige Dicke der Kupferlösung ergibt die besten Ergebnisse. Wenn im Agar während der Kupferlösungsanwendung Vertiefungen entstehen, sollte die Testplatte verworfen werden. Würmer können durch solche Löcher hauen 32, Besonders wenn sie mit einer aversiven Substanz oder Hungersnot konfrontiert sind. Um die Plattengleichförmigkeit zwischen den Proben zu gewährleisten, konnten gemischte Populationen von Würmern ( dh ein Mutanten- und Wildtyp) auf der gleichen Platte gemessen werden, wenn man eindeutig markiert war ( z . B. über GFP).
Obwohl dieser Assay auf Standard-Agarplatten durchgeführt wurde, können größere Platten verwendet werden ( z. B. 100 mm Durchmesser). In diesem Szenario sollte die Testdauer auf 6 Stunden verlängert werden, um genügend Zeit für die Wurmbewegung zu schaffen. Größere Platten könnten für die Prüfung von größeren Populationen und könnte verwendet werden, um zu untersuchen, wie Bevölkerungsdichte beeinflusst aversive Reaktionen über längere Zeiträume. Weiterhin technisch fortgeschrittene Verfahren könnten auch mit der Verwendung von Wurmverfolgungsgeräten verbunden sein, die mit einer beweglichen Stufe 33 gekoppelt sind. Die Wurmverfolgung würde genauere Messungen ermöglichen und die Erfassung zusätzlicher Variablen ermöglichen ( z
Der Assay kann leicht angepasst werden, um die Messung alternativer Phänotypen zu ermöglichen. Das Alter des Wurms kann variiert werden, um Messungen über altersbedingte Hunger-induzierte aversive Veränderungen zu ermöglichen. Darüber hinaus könnten Variationen des Ernährungszustands der experimentellen Würmer auch eine Analyse der Gewöhnung des Verhungerns im Zusammenhang mit der Nahrung und der chemischen Abneigung ermöglichen. Solange Protokolle unter vergleichbaren Datensätzen konsistent sind, könnte nahezu jede Vorkonditionierung von experimentellen Organismen über den Chemotaxis-Assay ausgewertet werden.
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Disclosures
Wir haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Naturwissenschaften und Ingenieurwissenschaften Council of Canada Discovery Grant RGPIN36481-08 an William G. Bendena unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| M9 Solution [3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, 1 ml 1 M MgSO4, H2O to 1 litre. Autoclave to sterilize before use.] | Produced in lab | ||
| Cupric Sulfate | Sigma | C-1297 | Use water to appropriately suspend to a concentration of 0.5M |
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