Summary
Deux méthodes basées sur la biotinylation, conçues pour déterminer l'expression de la surface cellulaire et la vitesse endocytaire des protéines exprimées à la membrane plasmatique, sont présentées dans ce rapport.
Abstract
Les protéines de surface cellulaire font appel à un large éventail de fonctions. Dans de nombreux cas, leur activité est régulée par des processus endocytaires qui modulent leurs niveaux à la membrane plasmique. Ici, nous présentons des protocoles détaillés pour 2 méthodes qui facilitent l'étude de tels procédés, tous deux basés sur le principe de la biotinylation des protéines de surface cellulaire. Le premier est conçu pour permettre la détermination semi-quantitative des niveaux relatifs d'une protéine particulière à la surface de la cellule. Dans celui-ci, les résidus de lysine des protéines de la membrane plasmique des cellules sont d'abord marqués avec un fragment de biotine. Une fois que les cellules sont lysées, ces protéines peuvent ensuite être précipitées spécifiquement par l'utilisation de streptavidine immobilisée par agarose en exploitant l'affinité naturelle de cette dernière pour la biotine. Les protéines isolées de cette manière peuvent ensuite être analysées par une méthode standard de Western Blot. La deuxième méthode fournit un moyen de déterminer le taux endocytique d'une particuleAr cellule cible sur une période de temps. Les protéines de surface cellulaire sont d'abord modifiées avec un dérivé de biotine contenant une liaison dissulfure clivable. Les cellules sont ensuite décalées vers des conditions de culture normales, ce qui provoque l'absorption endocytaire d'une proportion de protéines biotinylées. Ensuite, les liaisons disulfure de groupes de biotine non internalisés sont réduites en utilisant l'agent réducteur imperméable à la membrane, le glutathion. Grâce à cette approche, les protéines endocytesées peuvent donc être isolées et quantifiées avec un haut degré de spécificité.
Introduction
Les protéines à la surface de la cellule jouent une variété de rôles essentiels au maintien de la fonction cellulaire. Dans de nombreux cas, leur activité dépend ou est modulée par des processus endocytaires qui les séquestrent temporairement dans des sites intracellulaires ou qui les dirigent vers des voies de dégradation 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Ici, nous mettons en évidence 2 approches basées sur la biotinylation conçues pour permettre à l'utilisateur d'étiqueter et d'isoler spécifiquement les protéines exprimées à la membrane plasmatique et celles nouvellement internalisées. Grâce à ces méthodes, l'expression de la surface cellulaire et le taux endocytique de toute protéine d'intérêt peuvent être quantifiés, ce qui permet d'obtenir une évaluation plus claire de sa réglementation.
Détermination de l'expression relative de la protéine de surface cellulaire par biotinylation
La biotine, ou la vitamine B7, anciennement connue sous le nom de vitamine H 6 , est une petite molécule hydrosoluble qui peut être utilisée pour modifier chimiquement les groupes réactifs d'amine, de sulfhydryle et de carboxyle de molécules biologiques. La récolte actuelle des réactifs de biotinylation de surface cellulaire consiste principalement en des esters de biotine ou de dérivés N-hydroxysuccinimides (sulfo-NHS) à base de membrane imperméables à la membrane, conçus pour réagir avec les amines présentes sur les chaînes latérales de résidus de lysine de protéines exprimées à La surface de la cellule lorsque ceux-ci deviennent déprotonés dans des conditions basiques, ce qui entraîne la formation d'une liaison amide avec la fraction de biotine 7 . Les protéines de surface cellulaire ainsi modifiées peuvent ensuite être isolées par l'utilisation d'avidine, une protéine tétramère de 66 à 69 kDa possédant une grande affinité pour la biotine, se liant à celle-ci avec une constante de dissociation d'environ 10 à 15 , la marquant comme l'une des Les interactions non covalentes les plus fortes connues 8 , 9 .
Un certain nombre de méthodes alternatives de quantification de l'expression des protéines à la surface de la cellule ont été utilisées dans des études antérieures. L'étiquetage de cellules non perméabilisées utilisant des anticorps marqués par fluorescence spécifiques de la protéine d'intérêt, suivi par la visualisation par microscopie par fluorescence, par exemple, est une approche couramment utilisée, mais dépend fortement de la disponibilité d'anticorps qui peuvent se lier à des epitopes extracellulaires. Plus récemment, des procédés impliquant l'utilisation de protéines chimères contenant des fluorophores sensibles au pH qui réagissent pour être exposés à des milieux acides ont également été utilisés avec succès 10 . Cependant, de tels tests impliquent habituellement l'expression exogène de ces constructions dans des lignées cellulaires dans lesquelles la protéine d'intérêt n'est pas trouvée nativement. Ces approches sont néanmoins capables de fournir des informations précieuses concernant la localisation subcellulaire et l'itinéraire exoctique de laCible, et devrait donc être utilisé conjointement avec les approches basées sur la biotinylation décrites ici si les outils sont disponibles.
Dans un dosage de biotinylation typique, les cellules sont tout d'abord lavées à fond dans du PBS à 4 ° C. Cela élimine toute traces de protéines sériques introduites par le milieu de culture, ce qui garantit que celles-ci ne consommeront pas d'excès de quantité de biotine dans l'étape suivante. Plus important encore, la réduction de la température entraîne une décélération significative de l'endocytose. Le réactif de biotinylation est ensuite ajouté. Ensuite, les cellules sont à nouveau lavées, puis incubées avec un tampon de trempe contenant soit de la glycine soit du NH 4 Cl, dont le but est d'inactiver toutes les traces restantes de la biotine n'ayant pas réagi. Les cellules sont ensuite lysées, après quoi une streptavidine immobilisée à l'agarose est ajoutée pour précipiter les protéines biotinylées. L'analyse est généralement effectuée via Western Blot, ce qui permet l'expression relative de la surface cellulaire de divers prOteins à quantifier.
En raison de cette analyse, il convient à une utilisation uniquement avec des protéines possédant des parties exposées à l'environnement extracellulaire. Les protéines transmembranaires multipass, qui possèdent probablement un certain nombre de lysines réactives dans leurs régions en boucle, sont les plus favorables à cette méthode, tandis que les protéines à passage unique ont tendance à être moins susceptibles d'être biotinylées. Même dans ces cas, il existe une possibilité que des changements conformationnels ou des interactions intermoleculaires puissent occluser certains sites réactifs, ce qui entraîne un rendement de biotinylation inférieur à prévu.
Détermination du taux d'internalisation des protéines de surface cellulaire par biotinylation
Les principes de ce dosage sont largement similaires à ceux de la biotinylation de la surface cellulaire, avec un certain nombre d'exceptions, dont le plus important est l'utilisation de réactifs de biotinylation réversibles. Les groupes de biotine (de ceux-ci) possèdent le disuLfide bonds, dans leurs structures, susceptibles d'être réducteurs; Ceci est exploité pour s'assurer que seules les protéines de surface cellulaire prises dans les sites intracellulaires pendant la période d'analyse seront laissées biotinylées. Un dosage a généralement lieu de la manière suivante. Les cellules sont d'abord lavées et biotinylées avec des réactifs froids, puis un milieu de culture cellulaire à 37 ° C est réintroduit et les cellules sont renvoyées dans l'incubateur; Cela provoque une endocytose des protéines de surface cellulaire marquées. L'agent réducteur du glutathion - qui ne peut pas pénétrer dans la membrane - est ensuite ajouté pour briser les liaisons disulfure des fragments de biotine attachés aux protéines restant sur la surface de la cellule. Enfin, les liaisons disulfure cassées sont mises à réagir avec de l'iodoacétamide, consommant les groupes thiol labiles et empêchant les liaisons de se réformer. Comme auparavant, les cellules sont ensuite lysées, et les protéines marquées sont précipitées en utilisant de la streptavidine-agarose.
Le disque de limitationsDans la section précédente s'appliquent également ici en raison des similitudes partagées entre les méthodes. En outre, il convient de garder à l'esprit que les changements de température impliqués dans ce dosage empêchent la détermination exacte de la quantité de protéines endocytées pour chaque incrément de temps, en particulier dans le cas de protéines de recyclage rapidement ou rapidement recyclées. Le dosage ne fournit donc qu'une estimation semi-quantitative des taux endocytaires. La microscopie de fluorescence à réflexion interne totale peut être utilisée pour suivre l'absorption de chaque vésicule chargée et fournir une mesure plus précise de la cinétique de l'endocytose. Il peut donc fournir un complément très utile à ce dosage, en supposant qu'une construction chimère marquée par fluorescence de la protéine d'intérêt soit disponible 11 .
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Protocol
1. Détermination de l'expression relative des protéines de surface cellulaire dans les Astrocytes par Biotinylation
NOTE: Ici, nous illustrons l'application de cette technique de biotinylation à l'étude des effets de la molécule de molécule de matrice extracellulaire sur la localisation de la surface cellulaire du canal perméable à l'eau aquaporin-4 (AQP4). Les matériaux spécialisés requis pour ce dosage comprennent la sulfo-NHS-LC-biotine et la résine streptavidine-agarose (voir le tableau des matériaux ).
- En utilisant la méthode décrite dans Noel et al. 12 , préparer des cultures d'astrocytes corticales environ 2 semaines avant l'analyse et les cultiver dans des flacons de culture ventilés de 75 cm2. Lorsque les astrocytes sont 80 à 90% confluents, détachez-les de la surface de culture en utilisant 0,05% de trypsine, puis passez-les 1: 3.
- À 48 heures avant l'essai, lorsque les cellules sont de nouveau 80 à 90% de confluent, les astrocytes de passage 1: 3 (comptabilité pour le cHange dans le format de culture) sur des boîtes de culture cellulaire de 60 mm de sorte qu'ils soient> 70% confluent le jour de l'expérience. Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties entre les plats.
- A 16 h avant le dosage, pipeter laminine en milieu de culture jusqu'à une concentration finale de 24 nM, et incuber à 37 ° C.
- Immédiatement avant l'essai, préparez ce qui suit, puis placez-les sur de la glace ou réfrigérez: CM-PBS (100 mg / L de MgCl 2 ∙ 6H 2 O et 100 mg / L de CaCl2 dans 1X PBS, pH 7,4), tampon de biotine (0,5 Mg / ml de sulfo-NHS-LC-biotine dans CM-PBS), tampon de trempe (NH4Cl 50 mM dans CM-PBS), tampon de lyse (Tris 25 mM, pH 7,4, glycine 25 mM, NaCl 150 mM et 5 mM EDTA, 1% de triton X-100, cocktail d'inhibiteur de protease 1X), tampon de chargement 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS à 6%, glycérine à 30%, TNT 300 mM et bleu à 0,01% de bromophénol) et un tampon de lavage (10 mM Tris (pH 7,4), 1,5 mM d'EDTA, NaCl 150 mM, 1% de Triton X-100, cocktail d'inhibiteur de protéase 1X).
- RemOve plats tenant les cultures d'astrocytes de l'incubateur, et jeter le milieu.
- Laver les cellules trois fois avec 4 ml de CM-PBS refroidi et mettre la vaisselle sur de la glace écrasée.
- Pipeter 2 ml de tampon de biotine dans chaque puits et incliner délicatement les plats quelques fois pour assurer une couverture complète. Laissez la glace pendant 30 min.
- Retirez le tampon de biotine à l'aide d'un aspirateur et remplacez-le par un tampon de trempe de 4 mL. Laisser partir sur glace pendant 10 min.
- Aspirez le tampon de trempe et remplacez par un volume équivalent de celui-ci. Encore une fois, laisser partir sur glace pendant 10 min.
- Jeter le tampon de trempe et laver les cellules trois fois avec 4 ml de CM-PBS refroidi.
- Scraper les cellules dans 1 mL de CM-PBS refroidi à l'aide d'un élévateur de cellules et transférer la suspension au tube de microcentrifugeuse.
- Cellules de pastilles par centrifugation à 100 xg pendant 3 min. Jeter le surnageant et ré-suspendre les cellules dans 500 μL de tampon de lyse.
- Laisser les échantillons sur de la glace pendant 30 min, tourbillonner toutes les 5 min, ou plAcceptez-les sur un rotator de bout en bout à 4 ° C.
- Centrifuger le lysat à 14 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour granuler tous les matériaux insolubles dans le détergent. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse.
- Économisez 50 μL de ce lysat et ajoutez un tampon de chargement. Ensuite, le dénaturer en chauffant à 95 ° C dans un bain sec; Il s'agit de la fraction "entrée", contenant à la fois des protéines de surface cellulaire biotinylées, ainsi que des protéines cytosoliques non biotinylées.
- Augmenter l'ouverture d'une pointe de pipette en coupant environ 0,5 cm de matériau de son extrémité à l'aide d'une paire de ciseaux tranchants. À l'aide de cette pointe de pipette, transférez 75 μL de streptavidine-agarose (généralement stockées à 4 ° C) au lysat et incupez à 4 ° C pendant 3 h sur agitateur / balancier.
- Comme la streptavidine-agarose est fréquemment vendue sous la forme d'une bouillie contenant 50% de billes en volume, en suspension dans une solution antimicrobienne, triture la suspension pour s'assurer que les perlesSont régulièrement suspendus, puis pipettez 150 μL de suspension dans chaque échantillon.
- Perles de streptavidine-agarose en boulettes par centrifugation à 1500 xg pendant 30 s à 4 ° C.
- Économiser 50 μL du surnageant (ajouter un tampon de chargement et le dénaturer à 95 ° C dans un bain-marie ou un bloc chauffant); Cela représente la fraction "intracellulaire", et se compose principalement de protéines cytosoliques non biotinylées.
- Remettre en suspension les perles granulées dans un tampon de lavage de 1 mL et la faire chauffer pendant 3 min à 4 ° C. Perles de pastilles (comme à l'étape 1.16), et jeter le surnageant. Répétez ce processus 4x pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées.
- Pelleter les perles par centrifugation (1500 xg pendant 30 s à 4 ° C) et jeter le tampon de lavage supérieur. Ajouter 50 μL de tampon de chargement 1X (dilué à l'aide d'un tampon de lyse). Libérer la biotine et la streptavidine des billes en la dénaturant à 95 ° C; Cette fraction shoNe contiennent que des protéines de surface cellulaire biotinylées (fraction de "surface cellulaire").
- Séparer les fractions d'entrée, de surface cellulaire et intracellulaire par SDS-PAGE 13 et analyser par western blot 14 .
NOTE: Bien que nous utilisions un gel de gradient préfabriqué de 4 à 20% dans nos expériences, un gel de séparation de 12 à 14% avec une couche d'empilage de 4% (contenant chacun 0,1% de SDS) devrait suffire aux protéines intéressant cette étude. Un standard de poids moléculaire de la gamme de taille appropriée devrait également être utilisé. Notez qu'il peut y avoir parfois un changement de vitesse observable dans les masses moléculaires apparentes des protéines biotinylées.
- Séparer les fractions d'entrée, de surface cellulaire et intracellulaire par SDS-PAGE 13 et analyser par western blot 14 .
2. Détermination du taux d'internalisation des protéines cellulaires dans les Astrocytes par Biotinylation
NOTE: Dans ce qui suit, nous décrivons une expérience typique de biotinylation de pulsation utilisée dans cette instance pour suivre l'endocytose de AQP4 dans les astrocytes. CeLa méthode est basée sur celle utilisée par Madrid et al. 15 . Les matériaux spécialisés requis comprennent la sulfo-NHS-SS-biotine, la résine de streptavidine-agarose, le glutathion réduit et l'iodoacétamide (voir la Table des matériaux ).
- Préparer des cultures d'astrocytes corticales de souris dans des plaques de 60 mm en utilisant les méthodes décrites dans la section précédente. Assurez-vous que les cellules sont à peu près 70% confluent le jour de l'essai et que chaque plat contient un nombre équivalent de cellules.
- Immédiatement avant l'analyse, préparez les préparations suivantes et placez-les sur de la glace ou du réfrigérant: CM-PBS (100 mg / L de MgCl 2 ∙ 6H 2 O et 100 mg / L de CaCl2 dans 1X PBS, pH 7,4), tampon de biotine (0,5 Mg / ml de sulfo-NHS-SS-biotine dans CM-PBS), tampon de réduction (50 mM de glutathion réduit, NaCl 75 mM et NaOH 75 mM), tampon de trempe (iodoacétamide 50 mM, BSA à 1% dans CM-PBS) Un tampon de lyse (Tris 25 mM, pH 7,4, glycine 25 mM, NaCl 150 mM et EDTA 5 mM, 1% de triton X-100, 1Cocktail de inhibiteur de protéase X), tampon de chargement 3X (Tris 150 mM, pH 6,8, SDS à 6%, glycérol à 30%, TNT 300 mM et bleu de bromophénol 0,01%) et tampon de lavage (Tris 10 mM, pH 7,4, EDTA 1,5 mM, NaCl 150 mM, 1% de triton X-100, cocktail d'inhibiteur de protéase 1X).
- Préparer un milieu de culture cellulaire frais (DMEM supplémenté avec 10% de sérum de bovin fœtal (FBS), 1% de pénicilline / streptomycine et 1% de L-glutamine) et le placer dans un bain-marie à 37 ° C.
- Retirer les cultures d'astrocytes de l'incubateur et aspirer le milieu à l'aide d'un aspirateur.
- Laver les cellules trois fois avec 4 ml de CM-PBS refroidi et mettre la vaisselle sur de la glace écrasée.
- Pipettez 3 mL de tampon de biotine dans chaque plat, incluez les vaisselles plusieurs fois pour s'assurer que le tampon est bien réparti et laissez-le sur de la glace pendant 30 minutes.
- Aspirer le tampon de biotine et le remplacer par 5 ml de milieu chaud. Incuber un plat de culture à 37 ° C pendant 15 min, et un deuxième plat à la même température pendant 30 min. Laissez un autre plat à 46; C comme échantillon de 0 min.
- À la fin de la période d'incubation, jeter le milieu et laver les cellules trois fois avec 4 ml de CM-PBS refroidi. Pipettez 6 mL de tampon de réduction sur les cellules et laissez-les sur de la glace pendant 15 min.
- Retirez le tampon de réduction, puis remplacez-le par 6 ml de tampon réducteur frais. Placez-le sur de la glace pendant 15 minutes supplémentaires.
- Supprimez la solution réductrice et remplacez-la par un tampon de trempe de 6 ml. Laisser partir sur glace pendant 15 min.
- Répétez l'étape de trempe une fois de plus.
- Retirez le tampon de trempe et lavez les cellules trois fois avec 4 ml de PBS refroidi.
- Rince les cellules dans 1 mL de PBS refroidi à l'aide d'un levier de cellules et transférez la suspension dans un tube de microcentrifugeuse.
- Cellules de pastilles par centrifugation à 100 xg pendant 3 min. Jeter le surnageant et remettre à nouveau les cellules dans 500 μL de tampon de lyse.
- Laissez-le sur glace pendant 30 min et tourbillons toutes les 5 min. Alternativement, placez les échantillons sur un rotator de bout en bout à 4 ° C pour cette durée.
- Centrifugez-vousÀ 14 000 xg pendant 10 min à 4 ° C pour granuler les matériaux insolubles dans le détergent, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugeuse. Économisez 50 μL de ce lysat, ajoutez un tampon de chargement et décrivez à 95 ° C dans un bain sec; Il s'agit de la fraction "entrée", contenant à la fois des protéines endocytasées biotinylées, ainsi que des protéines non biotinylées.
- À l'aide d'une pointe de pipette découpée, ajouter 150 μL de la suspension de streptavidine-agarose au lysat et incuber à 4 ° C pendant 3 h sur agitateur / balancier. Voir 1.15 pour plus de détails sur cette étape.
- Perles de streptavidine-agarose en boulettes par centrifugation à 1500 xg pendant 30 s à 4 ° C.
- Remettre les billes en suspension dans un tampon de lavage de 1 mL et faire la roche pendant 3 min à 4 ° C. Perles de pastilles (selon l'étape 2.18), et jeter le surnageant. Répétez ce processus 4x pour minimiser la liaison non spécifique des protéines cytosoliques non biotinylées.
- Perles de pastilles par centrifugation à 1.500 xg pendant 30 s, à 4 ° C, et éliminerBouchon de lavage. Ajouter 50 μL de tampon de chargement 1X (dilué à l'aide d'un tampon de lyse). Libérer la biotine et la streptavidine des billes en dénaturant à 95 ° C; Cette fraction ne doit contenir que des protéines internes de surface cellulaire (fraction "endocytée").
- Séparer les fractions d'entrée, de surface cellulaire et non liées par SDS-PAGE 13 et analyser par western blot 14 .
NOTE: Bien que nous utilisions un gel de gradient préfabriqué de 4 à 20% dans nos expériences, un gel de séparation de 12 à 14% avec une couche d'empilage de 4% (contenant chacun 0,1% de SDS) devrait suffire aux protéines intéressant cette étude. Un standard de poids moléculaire de la gamme de taille appropriée devrait également être utilisé. Notez qu'il peut y avoir parfois un changement de vitesse observable dans les masses moléculaires apparentes des protéines biotinylées.
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Representative Results
Utilisation de la biotinylation de la surface cellulaire pour évaluer l'expression de la membrane plasmatique de l'AQP4 dans les astrocytes
Les cultures d'astrocytes traitées à la laminine et les cellules témoins non traitées ont été soumises à une biotinylation de surface cellulaire en utilisant les méthodes décrites. Les protéines biotinylées ont été précipitées avec de la streptavidine conjuguée à de l'agarose, puis séparées par SDS-PAGE. Les fractions de surface cellulaire ont été sondées pour AQP4 et β-dystroglycan (β-DG) en tant que contrôle de charge de surface cellulaire, tandis que l'entrée et les fractions intracellulaires ont été transférées pour AQP4 et β-actine ( Figure 1 A ) comme témoin de chargement. Les intensités de bande pour la fraction de surface cellulaire ont été quantifiées par densitométrie et les niveaux d'AQP4 pour chaque ensemble de cellules ont d'abord été normalisés par rapport aux valeurs de β-DG et ces rapports ont ensuite été normalisés par rapport à ceux des cellules témoins. L'histogramme ( figure 1 B ) représente les valeurs moyennes ± SEM pour trois expériences indépendantes. Le traitement par laminage, en moyenne, provoque une augmentation de près de 2 fois dans AQP4 exprimée à la surface de la cellule.
Etude du taux endocytaire d'AQP4 en utilisant la biotinylation
L'endocytose AQP4 dans les astrocytes a été suivie sur une période de 30 minutes. En bref, un analogue de biotine clivable a d'abord été utilisé pour étiqueter des protéines de surface dans 3 plats d'astrocytes. Les cellules ont été déplacées à 37 ° C pendant 0, 15 et 30 min respectivement, pendant lesquelles les protéines marquées ont été internalisées. L'étiquetage qui est resté à la surface a ensuite été éliminé en utilisant un agent réducteur, et les protéines endocytées ont été précipitées avec de la streptavidine conjuguée à de l'agarose. Après la séparation par SDS-PAGE, on a ensuite sondé pour AQP4 ( Figure 2 A ). Les niveaux d'AQP4 ont été quantifiés en utilisant la densitométrie, et les valeurs correspondant auLes temps de 15 et 30 minutes ont été normalisés à ceux pour l'échantillon de 0 min. L'histogramme ( Figure 2 B ) représente les valeurs moyennes ± SEM pour quatre expériences de ce type.
Figure 1 . Expression AQP4 à la surface cellulaire en présence de Laminin. (A) Les fractions cellulaire, intracellulaire et totale (Entrée) des astrocytes non traités (-LN) et des astrocytes traités avec 24 nM de laminine-111 (+ LN) ont été sondées pour AQP4 et β-DG. (B) Histogramme illustrant les différences dans les niveaux de surface cellulaire d'AQP4 non traitées et les astrocytes traités à la laminine, normalisés par rapport aux niveaux β-DG. Les valeurs représentent des intensités de pixels moyennes normalisées ± SEM, exprimées par rapport aux valeurs pour les cellules témoins. L'astérisque indique une statistiqueUne augmentation significative de l'AQP4, déterminée par un test t de Student à deux têtes (n = 3, * p = 0,033). Ce chiffre a été modifié de Tham et al. 16 Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 . AQP4 Internalization in Astrocytes. (A) Les protéines internalisées par les cultures d'astrocytes à 0, 15 et 30 min ont été sondées pour AQP4. (B) Histogramme résumant les taux d'internalisation de AQP4 pour 4 expériences indépendantes, normalisées par rapport aux valeurs pour le point de temps 0 min. L'astérisque indique une augmentation statistiquement significative de la quantité d'AQP4 endocytée entre 15 et 30 minutes, déterminée par une queue à deuxLe test t de Student (n = 3, * p = 0,017). (C) Lorsque le glutathion est utilisé pour casser la liaison disulfure dans l'analogue de la biotine clivable, la contribution de la surface cellulaire AQP4 à la fraction biotinylée est fortement réduite, ce qui entraîne une nette différence entre les échantillons de 0 et 15 minutes (C, en haut à gauche ) . Lorsque cette étape est omise, le signal provenant du pool de surface de cellule rend la modification entre les 2 points de temps indétectables (C, en haut à droite) . Ce chiffre a été modifié de Tham et al. 16 Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Modifications:
Comme ces méthodes ont été conçues pour être utilisées avec des cellules adhérentes, nous avons spécifié l'utilisation de PBS contenant 100 mg / L de MgCl 2 ∙ 6H 2 O et
100 mg / L de CaCl2 (CM-PBS) pour les étapes de lavage et comme base de certains tampons afin de s'assurer que les cellules restent attachées à la surface de culture et que les jonctions cellule-cellule ne sont pas perturbées. Cependant, les protocoles peuvent également être appliqués à des types de cellules non adhérentes si les cellules sont granulées entre chaque étape de la procédure. Dans ces cas, CM-PBS peut être remplacé par PBS.
En outre, il est important de noter que chacune des conditions mentionnées ici est spécifique à ce protocole, et ne doit être considérée que comme des directives approximatives si les méthodes doivent être utilisées pour d'autres applications. En particulier, il faut vérifier de manière indépendante que la procédure d'extraction du détergent est appropriée pourType de cellule r, et que les réglages de la centrifugeuse sont appropriés pour le type de cellule et pour les perles de streptavidine-agarose utilisées.
Enfin, s'il existe des inquiétudes concernant la liaison non spécifique et / ou des antécédents excessifs, on peut substituer la streptavidine aux diverses autres formes d'avidine actuellement disponibles sur le marché. L'avidine déglycosylée, par exemple, a une affinité significativement plus faible pour les lectines et pour les molécules à charge négative telles que l'ADN.
Dépannage et contrôles:
Bien que les procédures examinées dans le présent rapport soient assez simples, il faut tenir compte d'un certain nombre de problèmes critiques susceptibles d'affecter le résultat de l'expérience. Tout d'abord, bien que les deux tests dépendent fortement de la nature imperméable aux membranes des réactifs de biotinylation sulfatés, certaines conditions pourraient provoquer une perturbation de la membrane plasmique des cellules, ce qui entraînerait une certaine protection intracellulaireIns biotinylé. Pour contrôler cette possibilité, il est suggéré que les fractions biotinylées soient sondées pour des cibles connues pour ne pas être exprimées à la membrane plasmatique, comme la β-actine.
Il faut faire attention à respecter les conditions de stockage appropriées pour les réactifs de biotinylation (typiquement 4 ou -20 ° C, avec une certaine forme de dessiccation), car ils peuvent échouer autrement, en raison de leur nature très sensible. Néanmoins, il est bon de sonder les fractions d'entrée, biotinylées et non biotinylées avec la streptavidine-HRP pour s'assurer que la biotinylation s'est effectivement produite et que les protéines biotinylées ont été précipitées efficacement (ce qui sera évident à partir de l'absence de signal dans le Fraction non biotinylée). Cela devrait permettre d'éliminer la possibilité de réactifs défectueux.
La réduction de la liaison des disulfures est une étape cruciale dans la procédure de biotinylation endocytaire, car elle assureQue seules les protéines internalisées seront isolées dans la fraction biotinylée. L'incorporation des contrôles dans lesquels le réactif réducteur est omis ( figure 1 C ) permet d'obtenir une impression de l'efficacité du traitement.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêt.
Acknowledgments
Ce projet a été soutenu par l'Institut canadien de recherche en santé PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
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