Summary
To biotinyleringsbaserte metoder, utformet for å bestemme celleoverflateekspresjonen og endocytisk hastighet av proteiner uttrykt ved plasmamembranen, presenteres i denne rapporten.
Abstract
Cell-overflateproteiner formidler et bredt spekter av funksjoner. I mange tilfeller er deres aktivitet regulert av endocytiske prosesser som modulerer nivåene deres ved plasmamembranen. Her presenterer vi detaljerte protokoller for 2 metoder som letter undersøkelsen av slike prosesser, som begge er basert på biotinylering av celleoverflateproteiner. Den første er utformet for å tillate den semikvantitative bestemmelse av de relative nivåene av et bestemt protein ved celleoverflaten. I det er lysinrester av plasmamembranproteiner av celler først merket med en biotinnedel. Når cellene lyseres, kan disse proteinene deretter spesifikt utfelles via bruk av agarose-immobilisert streptavidin ved å utnytte den naturlige affiniteten til sistnevnte for biotin. Proteinene isolert på en slik måte kan deretter analyseres via en standard western blotting-tilnærming. Den andre fremgangsmåten gir et middel for å bestemme endocytisk hastighet av et partikkelAr celleoverflate mål over en tidsperiode. Cell-overflateproteiner blir først modifisert med et biotinderivat som inneholder en spaltbar disulfidbinding. Cellene blir deretter skiftet tilbake til normale dyrkningsbetingelser, hvilket forårsaker endocytisk opptak av en andel biotinylerte proteiner. Deretter reduseres disulfidbindingene til ikke-internaliserte biotingrupper ved bruk av det membran-impermeable reduksjonsmiddelet glutation. Via denne tilnærmingen kan endocytoserte proteiner således isoleres og kvantifiseres med en høy grad av spesifisitet.
Introduction
Proteiner på celleoverflaten spiller en rekke roller sentralt for å opprettholde cellefunksjonen. I mange tilfeller er deres aktivitet avhengig av eller modulert av endocytiske prosesser som enten midlertidig sekvestrerer dem i intracellulære områder, eller som leder dem mot nedbrytningsveier 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Her fremhever vi 2 biotinyleringsbaserte tilnærminger designet for å tillate brukeren å spesifikt merke og isolere proteiner uttrykt ved plasmamembranen, og de nylig internaliserte. Via disse metodene kan celleoverflateekspresjonen og endocytisk hastighet for et hvilket som helst protein av interesse kvantifiseres, slik at en klarere vurdering av dens regulering kan oppnås.
Bestemmelse av relativ celleoverflateproteinuttrykk ved biotinylering
Biotin, eller vitamin B7, tidligere kjent som vitamin H6, er et lite vannløselig molekyl som kan brukes til å kjemisk modifisere reaktive amin, sulfhydryl og karboksylgrupper av biologiske molekyler. Den nåværende avlingen av biotinyleringsreagenser av celleoverflate består hovedsakelig av membran-impermeant sulfonerte N-hydroksysuccinimid (sulfo-NHS) estere av biotin eller dets derivater, designet for å reagere med aminer tilstede på sidekjeder av lysinrester av proteiner uttrykt ved Celleoverflaten når disse blir deprotonert under basiske betingelser, hvilket resulterer i at sistnevnte danner en amidbinding med biotindelen 7 . Således modifiserte, celleoverflateproteiner kan deretter isoleres ved bruk av avidin, et 66-69 kDa tetramert protein som har stor affinitet for biotin, bindende til sistnevnte med en dissosiasjonskonstant på ca. 10-15 , som markerer den som en av de Sterkeste ikke-kovalente interaksjoner kjent 8 , 9 .
Et antall alternative metoder for kvantifisering av proteinuttrykk på celleoverflaten har blitt brukt i tidligere studier. Merking av upermeabiliserte celler ved bruk av fluorescens-merkede antistoffer som er spesifikke for protein av interesse, etterfulgt av visualisering via fluorescensmikroskopi, er for eksempel en vanlig benyttet tilnærming, men er sterkt avhengig av tilgjengeligheten av antistoffer som kan binde til ekstracellulære epitoper. Mer nylig har metoder som involverer bruk av kimære proteiner som bærer pH-følsomme fluoroforer som reagerer på å bli utsatt for sure medier, også blitt anvendt med suksess 10 . Imidlertid involverer slike analyser vanligvis den eksogene ekspresjon av disse konstruksjonene i cellelinjer hvor proteinet av interesse ikke er funnet naturlig. Disse tilnærmingene er likevel i stand til å gi verdifull informasjon om subcellulær lokalisering og eksocytisk reiserute avMålprotein, og bør derfor brukes sammen med biotinyleringsbaserte tilnærminger som beskrives her hvis verktøyene er tilgjengelige.
I en typisk biotinyleringsanalyse vaskes cellene først grundig i 4 ° C PBS. Dette fjerner spor av serumproteiner introdusert av dyrkingsmediet, og sikrer dermed at disse ikke vil forbruke overflødige mengder biotin i neste trinn. Enda viktigere, reduksjonen i temperaturen forårsaker endocytose å senke betydelig. Biotinyleringsreagenset blir så tilsatt. Deretter vaskes cellene igjen og inkuberes deretter med en slokkingsbuffer som inneholder enten glycin eller NH4Cl, hvis formål er å inaktivere alle resterende spor av uomsatt biotin. Cellene lyseres deretter, hvoretter agarose-immobilisert streptavidin blir tilsatt for å utfelle de biotinylerte proteiner. Analyse utføres vanligvis via western blotting, slik at den relative celleoverflateekspresjon av forskjellige prOteins å bli kvantifisert.
På grunnlag av grunnlaget for denne analysen er den egnet for bruk bare med proteiner som har deler som er utsatt for det ekstracellulære miljø. Multipass transmembrane proteiner, som sannsynligvis har en rekke reaktive lysiner innenfor deres sløyfeområder, er mest mottagelige for denne metoden, mens enkeltpasproteiner har en tendens til å være mindre utsatt for biotinylering. Selv i disse tilfellene er det fortsatt en mulighet for at konformasjonsendringer eller intermolekylære interaksjoner kan utelukke visse reaktive steder, noe som resulterer i et lavere enn forventet biotinyleringsutbytte.
Bestemme internaliseringshastigheten av celleoverflateproteiner ved biotinylering
Prinsippene for denne analysen er i stor grad likt den av celleoverflatebiotinylering, med en rekke unntak, hvorav det viktigste er bruk av reversible biotinyleringsreagenser. Biotingruppene (av disse) har disuLfide bindinger, innenfor deres strukturer, som er mottakelige for reduksjonsmidler; Dette utnyttes for å sikre at bare celleoverflateproteiner tatt inn i intracellulære steder i assayperioden vil bli biotinylert. En analyse utføres generelt på følgende måte. Cellene vaskes først og biotinyleres med kaldreagenser, deretter gjenvinnes celledyrkningsmedium ved 37 ° C, og cellene returneres til inkubatoren. Dette fører til at de merkede celleoverflateproteinene gjennomgår endocytose. Reduksjonsmiddelet glutation - som ikke kan trenge inn i membranen - blir så tilsatt for å bryte disulfidbindingene av biotinnene festet til proteiner som er igjen på celleoverflaten. Til slutt omsattes de brutte disulfidbindingene med jodacetamid, forbruker de labile tiolgruppene og forhindrer bindingene fra å reformere. Som tidligere lyseres cellene deretter, og de merkede proteiner utfelles under anvendelse av streptavidin-agarose.
Begrensningene diskenBrukes i den forrige delen gjelder også her på grunn av likhetene som deles mellom metodene. I tillegg er det verdt å huske på at temperaturforskyvene som er involvert i denne analysen, utelukker den nøyaktige bestemmelse av hvor mye protein som er endocytosed for hvert tidsforløp, spesielt når det gjelder raskt internaliserte eller raskt resirkulerende proteiner. Analysen gir derfor bare en semiquantitative estimering av endocytiske hastigheter. Total internrefleksjon fluorescensmikroskopi kan brukes til å spore opptaket av hver lastet vesikkel og gi en mer presis måling av kinetikken til endocytose. Det kan derfor gi et meget nyttig komplement til denne analysen, forutsatt at en fluorescensmerket merket kimær konstruksjon av proteinet av interesse er tilgjengelig 11 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bestemmelse av relativ celloverflateproteinuttrykk i astrocytter ved biotinylering
MERK: Her illustrerer vi anvendelsen av denne biotinyleringsteknikken til studiet av virkningene av det ekstracellulære matriksmolekylet laminin på lokaliseringen av celleoverflaten av den vannpermeable kanalen aquaporin-4 (AQP4). Spesialmaterialer som kreves for denne analysen inkluderer sulfo-NHS-LC-biotin og streptavidin-agaroseharpiks (se tabell over materialer ).
- Ved å bruke metoden som er skissert i Noel et al. 12 , lag kulturer av kortikale astrocytter ca. 2 uker før analysen, og dyrk dem i 75 cm 2 ventilerte dyrkningsflasker. Når astrocytter er 80 - 90% sammenflytende, løsne dem fra kulturoverflaten ved å bruke 0,05% trypsin, og deretter passere dem 1: 3.
- Ved 48 timer før analysen, når cellene igjen er 80 - 90% sammenflytende, passerer astrocytter 1: 3 (regner med cHange i kulturformatet) på 60 mm cellekulturretter slik at de er> 70% sammenføyende den dagen forsøket skal finne sted. Sørg for at cellene er jevnt fordelt mellom retter.
- Ved 16 timer før analysen pipetteres laminat i kulturmedium til en sluttkonsentrasjon på 24 nM og inkuberes ved 37 ° C.
- Umiddelbart før analysen utarbeides følgende, og deretter plasseres på is eller kjøleskap: CM-PBS (100 mg / L MgCl2 × 6H 2 O og 100 mg / L CaCl2 i 1X PBS, pH 7,4), biotinbuffer (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-LC-biotin i CM-PBS), quenchingsbuffer (50 mM NH4Cl i CM-PBS), lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycin, 150 mM NaCl og 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X proteaseinhibitor cocktail), 3X loading buffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glyserol, 300 mM DTT og 0,01% bromfenolblått) og vaskebuffer Tris (pH 7,4), 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1X proteaseinhibitor cocktail).
- RemOve-retter som holder astrocytkulturer fra inkubatoren og kasserer mediet.
- Vask celler tre ganger med 4 ml kjølt CM-PBS, og plasser oppvasken på knust is.
- Pipetter 2 ml biotinbuffer i hver brønn, og forsiktig tippe retter frem og tilbake et par ganger for å sikre fullstendig dekning. La på is i 30 min.
- Fjern biotinbufferen ved hjelp av en aspirator, og erstatt med 4 ml quenching buffer. La på is i 10 min.
- Aspirer slokkingsbufferen, og erstatt med et tilsvarende volum av det samme. Igjen, la på is i 10 minutter.
- Kast slokkingsbufferen og vaske celler tre ganger med 4 ml kjølt CM-PBS.
- Skrape celler inn i 1 ml avkjølt CM-PBS ved hjelp av en celle løfter, og overfør suspensjonen til mikrocentrifugerøret.
- Pelletsceller ved sentrifugering ved 100 xg i 3 min. Kast supernatanten og resuspender celler i 500 μl lysisbuffer.
- La prøver på is i 30 minutter, vortex hver 5 min eller plEs dem på en end-end-end rotator ved 4 ° C.
- Sentrifuger lysatet ved 14.000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for å pelletere eventuelle vaskemiddeluopløselige materialer. Overfør supernatanten til et nytt mikrocentrifugerør.
- Lag 50 μL av dette lysatet og legg til påføringsbuffer til det. Denaturer den deretter ved oppvarming ved 95 ° C i et tørt bad; Dette er "inngangsfraksjonen", som inneholder både biotinylerte celleoverflateproteiner, samt ikke-biotinylerte cytosoliske proteiner.
- Forleng åpningen av en pipettespiss ved å kutte ca. 0,5 cm materiale fra sin ende ved hjelp av et par skarpe saks. Ved å bruke denne pipettespissen, overfør 75 μL streptavidin-agarosekuler (normalt lagret ved 4 ° C) til lysatet, og inkuber ved 4 ° C i 3 timer på rister / vippeledd.
- Da streptavidin-agarose ofte blir solgt som en oppslemming inneholdende 50 volumper perler per volum, suspendert i en antimikrobiell oppløsning, triturater oppslemmingen for å sikre at perleneBlir jevnt suspendert, og pipetter deretter 150 μl av suspensjonen i hver prøve.
- Pellet streptavidin-agarose perler ved sentrifugering ved 1500 xg i 30 s ved 4 ° C.
- Lag 50 μL av supernatanten (legg til påføringsbuffer og denaturer den ved 95 ° C i et vannbad eller en varmeblokk); Dette representerer den "intracellulære" fraksjon, og består hovedsakelig av ikke-biotinylerte cytosoliske proteiner.
- Resuspender de pelleterte perlene i 1 ml vaskebuffer, og stein denne i 3 minutter ved 4 ° C. Pelletperler (som i trinn 1.16), og kast supernatanten. Gjenta denne prosessen 4x for å minimere den ikke-spesifikke bindingen av ikke-biotinylerte cytosoliske proteiner.
- Pellet perlene ved sentrifugering (1500 xg i 30 s ved 4 ° C), og kast den overliggende vaskebufferen. Tilsett 50 μl 1 x påføringsbuffer (fortynnet ved bruk av lysebuffer). Frigiv biotin og streptavidin fra perler ved denaturering dette ved 95 ° C; Denne fraksjonen shoUld inneholder bare biotinylerte celleoverflateproteiner ("celleoverflate" fraksjon).
- Separat inngang, celleoverflate og intracellulære fraksjoner ved SDS-PAGE 13 og analysere ved western blotting 14 .
MERK: Mens vi brukte en 4 - 20% forgassgradientgel i våre eksperimenter, bør en 12-14% separeringsgel med et 4% stablingslag (hver inneholdende 0,1% SDS) være nok for proteinene av interesse i denne studien. En molekylvektstandard av passende størrelsesområde bør også benyttes. Merk at det noen ganger kan være en observerbar oppskifting i de tilsynelatende molekylmassene av biotinylerte proteiner.
- Separat inngang, celleoverflate og intracellulære fraksjoner ved SDS-PAGE 13 og analysere ved western blotting 14 .
2. Bestemmelse av interniseringsfrekvens for celloverflateproteiner i astrocytter ved biotinylering
MERK: I det følgende beskriver vi et typisk pulse-chase biotinyleringseksperiment som i dette tilfellet brukes til å spore endocytose av AQP4 i astrocytter. DetteMetoden er basert på den som brukes av Madrid et al. 15 . Spesialmaterialer som kreves inkluderer sulfo-NHS-SS-biotin, streptavidin-agaroseharpiks, redusert glutation og jodacetamid (se tabell over materialer ).
- Forbered kulturer av musekortiske astrocytter i 60 mm-retter ved å bruke metodene som er skissert i forrige avsnitt. Sørg for at cellene er omtrent 70% konfluente på analysedagen, og at hver tallerken inneholder et tilsvarende antall celler.
- Umiddelbart før analysen, utarbeide følgende og plasser på is eller kjøleskap: CM-PBS (100 mg / L MgCl 2 × 6H 2 O og 100 mg / L CaCl 2 i 1X PBS, pH 7,4), biotinbuffer (0,5 Mg / ml sulfo-NHS-SS-biotin i CM-PBS), reduserende buffer (50 mM redusert glutation, 75 mM NaCl og 75 mM NaOH), quenchingsbuffer (50 mM iodacetamid, 1% BSA, i CM-PBS) Lysisbuffer (25 mM Tris, pH 7,4, 25 mM glycin, 150 mM NaCl og 5 mM EDTA, 1% triton X-100, 1X-proteaseinhibitor-cocktail), 3 x påføringsbuffer (150 mM Tris, pH 6,8, 6% SDS, 30% glyserol, 300 mM DTT og 0,01% bromfenolblått) og vaskebuffer (10 mM Tris, pH 7,4, 1,5 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1% triton X-100, 1X proteaseinhibitor cocktail).
- Klargjør friskcellekulturmedium (DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptomycin og 1% L-glutamin) og plasser det i et 37 ° C vannbad.
- Fjern astrocytkulturer fra inkubatoren, og aspirer mediet ved hjelp av en aspirator.
- Vask celler tre ganger med 4 ml kjølt CM-PBS, og plasser oppvasken på knust is.
- Pipette 3 ml biotinbuffer i hver tallerken, vipp retter frem og tilbake et par ganger for å sikre at bufferen er godt fordelt, og la den stå på is i 30 minutter.
- Aspirer biotinbuffer, og erstatt den med 5 ml varmt medium. Inkubér en kulturrett ved 37 ° C i 15 minutter, og en annen tallerken ved samme temperatur i 30 minutter. La en annen tallerken være på 46; C som 0 min prøve.
- Ved slutten av inkubasjonsperioden, kast medium og vask celler tre ganger med 4 ml kjølt CM-PBS. Pipette 6 ml reduserende buffer over celler, og la på is i 15 minutter.
- Fjern reduksjonsbufferen, og erstatt deretter med 6 ml frisk reduksjonsbuffer. Plasser på is i ytterligere 15 min.
- Fjern reduksjonsløsning og erstatt med 6 ml quenching buffer. La på is i 15 min.
- Gjenta slokkingstrinn en gang til.
- Kast slokkingsbufferen og vaske celler tre ganger med 4 ml kjølt PBS.
- Skrape celler inn i 1 ml avkjølt PBS ved hjelp av en celleløfter, og overfør suspensjonen til et mikrocentrifugerør.
- Pelletsceller ved sentrifugering ved 100 xg i 3 min. Kast supernatanten og resuspender celler i 500 μl lysisbuffer.
- La det stå på is i 30 minutter og virvel hver 5 min. Alternativt, plasser prøvene på en end-over-end rotator ved 4 ° C for denne varigheten.
- Sentrifuger lySate ved 14 000 xg i 10 minutter ved 4 ° C for å pelletere det vaskemiddeluopløselige materialer, og deretter overføre supernatant til et nytt mikrocentrifugerør. Lag 50 μl av dette lysatet, legg til påføringsbuffer og denaturer ved 95 ° C i et tørt bad; Dette er "inngangsfraksjonen", som inneholder både biotinylerte endocytoserte proteiner, samt ikke-biotinylerte proteiner.
- Ved hjelp av en snittpipettespiss, tilsett 150 μL streptavidin-agaroseslurryen til lysatet, og inkuber ved 4 ° C i 3 timer på shaker / rocker. Se 1.15 for ytterligere detaljer om dette trinnet.
- Pellet streptavidin-agarose perler ved sentrifugering ved 1500 xg i 30 s ved 4 ° C.
- Resuspender perler i 1 ml vaskebuffer, og stein i 3 minutter ved 4 ° C. Pelletsperler (som i trinn 2.18), og kast supernatanten. Gjenta denne prosessen 4x for å minimere den ikke-spesifikke bindingen av ikke-biotinylerte cytosoliske proteiner.
- Pelletsperler ved sentrifugering ved 1500 xg i 30 s, ved 4 ° C og kast bort ovnenVaskende buffer. Tilsett 50 μl 1X ladingsbuffer (fortynnet ved bruk av lysebuffer). Frigiv biotin og streptavidin fra perler ved denaturering ved 95 ° C; Denne fraksjonen bør bare inneholde interniserte celleoverflateproteiner ("endocytosed" fraksjon).
- Separat inngang, celleoverflate og ubundne fraksjoner ved SDS-SIDE 13 , og analyser ved western blotting 14 .
MERK: Mens vi brukte en 4 - 20% forgassgradientgel i våre eksperimenter, bør en 12-14% separeringsgel med et 4% stablingslag (hver inneholdende 0,1% SDS) være nok for proteinene av interesse i denne studien. En molekylvektstandard av passende størrelsesområde bør også benyttes. Merk at det noen ganger kan være en observerbar oppskifting i de tilsynelatende molekylmassene av biotinylerte proteiner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruke celleoverflatebiotinylering for å vurdere plasmamembranuttrykket av AQP4 i astrocytter
Lamininbehandlede astrocytkulturer og ubehandlede kontrollceller ble utsatt for celleoverflatebiotinylering ved anvendelse av de beskrevne metoder. Biotinylerte proteiner ble utfelt med agarose-konjugert streptavidin og deretter separert via SDS-PAGE. Cell-overflatefraksjoner ble undersøkt for AQP4 og β-dystroglykan (β-DG) som en celleoverfladestyringskontroll, mens inngangs- og intracellulære fraksjoner ble blottet for AQP4 og ß-actin ( Figur 1A) som en lastkontroll. Båndintensiteter for celleoverflatefraksjonen ble kvantifisert via densitometri, og AQP4-nivåer for hvert sett av celler ble først normalisert mot p-DG-verdier, og disse forholdene ble deretter normalisert mot de for kontrollcellene. Histogrammet ( Figur 1 B ) representerer middelverdiene ± SEM for tre uavhengige eksperimenter. Lamininbehandling medfører i gjennomsnitt en nær 2X økning i AQP4 uttrykt ved celleoverflaten.
Undersøkelse av endocytisk frekvens av AQP4 ved bruk av biotinylering
AQP4 endocytose i astrocytter ble sporet over en 30 min periode. Kort fortalt ble en spaltbar biotinanalog først brukt til å merke overflateproteiner i 3 retter av astrocytter. Cellene ble skiftet til 37 ° C i henholdsvis 0, 15 og 30 minutter, hvoretter de merkede proteiner ble internalisert. Mærkning som forblir på overflaten ble deretter fjernet under anvendelse av et reduksjonsmiddel, og endocyttede proteiner ble utfelt med agarose-konjugert streptavidin. Etter separasjon via SDS-PAGE ble disse undersøkt for AQP4 ( figur 2A). AQP4 nivåer ble kvantifisert ved bruk av densitometri, og verdiene tilsvarende ved15 og 30 min tidspunkter ble normalisert til de for 0 min-prøven. Histogrammet ( Figur 2B ) representerer de gjennomsnittlige verdier ± SEM for fire slike eksperimenter.
Figur 1 . AQP4-uttrykk ved cellens overflate i nærvær av laminat. (A) Cell-overflaten, intracellulær og total (Input) fraksjoner fra ubehandlede astrocytter (-LN) og astrocytter behandlet med 24 nM laminin-111 (+ LN) ble probet for AQP4 og β-DG. (B) Histogram som illustrerer forskjellene i celleoverflatenivåene av AQP4 ubehandlede og lamininbehandlede astrocytter, normalisert mot p-DG-nivåer. Verdier representerer normaliserte gjennomsnittlige pikselintensiteter ± SEM, uttrykt i forhold til verdiene for kontrollcellene. Stjernen angir en statisticaEn signifikant økning i AQP4, bestemt av en to-tailed Student's t- test (n = 3, * p = 0,033). Denne figuren er blitt modifisert fra Tham et al. 16 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2 . AQP4- interiørisering i astrocytter . (A) Proteiner internalisert av astrocytkulturer ved 0, 15 og 30 min ble probet for AQP4. (B) Histogram som oppsummerer internaliseringshastighetene for AQP4 for 4 uavhengige eksperimenter, normalisert mot verdier for 0 min tidspunkt. Asterisken indikerer en statistisk signifikant økning i mengden av AQP4 endocytosed mellom 15 og 30 minutter som bestemt av en to-haleEd Student t- test (n = 3, * p = 0,017). (C) Når glutation brukes til å bryte disulfidbindingen i den spaltbare biotinanalogen, blir bidraget fra celleoverflate AQP4 til den biotinylerte fraksjon kraftig redusert, noe som resulterer i en klar forskjell mellom 0 og 15 min-prøvene (C, øverst til venstre ) . Når dette trinnet utelates, gjør signalet som kommer fra celleoverflaten, endringen mellom de to tidspunkter som ikke kan detekteres (C, øverst til høyre) . Denne figuren er blitt modifisert fra Tham et al. 16 Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
modifikasjoner:
Da disse metodene ble konstruert for bruk med adherente celler, har vi spesifisert bruk av PBS som inneholder 100 mg / L MgCl2 · 6H20 og
100 mg / l CaCl2 (CM-PBS) for vaskingstrinnene og som base av visse buffere for å sikre at cellene forblir festet til kulturoverflaten og at cellekryssene ikke forstyrres. Protokollene kan imidlertid også brukes på ikke-adherente celletyper dersom cellene pelleteres i mellom hvert trinn i prosedyren. I disse tilfellene kan CM-PBS bli erstattet med PBS.
I tillegg er det viktig å merke seg at hver av betingelsene nevnt her er spesifikke for denne protokollen, og bør bare betraktes som grove retningslinjer hvis metodene skal brukes til andre applikasjoner. Spesielt bør man selvstendig verifisere at detergentutvinningsprosedyren er passende for denneR-celletype, og at sentrifugeringsinnstillingene er egnede for celletypen, og at streptavidin-agarosekulene blir brukt.
Til slutt, hvis det er bekymringer angående ikke-spesifikk binding og / eller overdreven bakgrunn, kan man erstatte streptavidin med de forskjellige andre avidinformer som nå er tilgjengelige på markedet. Deglykosylert avidin har for eksempel betydelig lavere affinitet for lektiner og for negativt ladede molekyler som DNA.
Feilsøking og kontroller:
Mens prosedyrene som er vurdert i denne rapporten, er ganske enkle, bør man være oppmerksom på en rekke kritiske problemer som potensielt kan påvirke utfallet av eksperimentet. For det første, mens begge analysene er sterkt avhengige av den membran-impermeante naturen av de sulfaterte biotinyleringsreagensene, kan visse forhold føre til at plasmamembranen i cellene blir forstyrret og derved resulterer i visse intracellulære proteinerIns er biotinylert. For å kontrollere for denne muligheten foreslås det at biotinylerte fraksjoner skal probes for mål som ikke er uttrykt ved plasmamembranen, slik som β-aktin.
Man bør være forsiktig med å følge de rette oppbevaringsbetingelsene for biotinyleringsreagensene (typisk 4 eller -20 ° C, med en eller annen form for uttørking), da disse kan mislykkes ellers på grunn av deres meget følsomme natur. Ikke desto mindre er det god praksis å sonde inntastede, biotinylerte og ikke-biotinylerte fraksjoner med streptavidin-HRP for å fastslå at biotinylering faktisk har skjedd, og at de biotinylerte proteiner har blitt effektivt utfelt (hvilket vil fremgå av fraværet av et signal i Ikke-biotinylert fraksjon). Å gjøre det bør muliggjøre eliminering av muligheten for defekte reagenser.
Reduksjon av disulfidbinding er et avgjørende skritt i den endocytiske biotinyleringsprosedyren, slik den sikrerAt bare internaliserte proteiner vil bli isolert i den biotinylerte fraksjonen. Inkludering av kontroller hvor det reduserende reagens utelates ( figur 1C ) gjør at man får et inntrykk av effekten av behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette prosjektet ble støttet av Canadian Institute of Health Research PG # 20R47867.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Fisher Scientific | A661-500 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647-50 | |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | #1610404 | |
| cOmplete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11697498001 | |
| Disodium Ethylenediaminetetraacetate dihydrate (EDTA) | Bio-Rad | #1610729 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | #1610611 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 11960-044 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21335 | |
| EZ-Link Sulfo-NHS-SS-Biotin | Thermo Fisher Scientific | #21331 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-1 | |
| Glycine | Sigma-Aldrich | G8898 | |
| Iodoacetamide | Bio-Rad | #163-2109 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich | L2020 | Thaw on ice. |
| L-glutamine | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 25030-081 | |
| Mouse monoclonal anti-β-actin antibody (AC-15) | Sigma-Aldrich | A5441 | |
| Mouse monoclonal anti-β-dystroglycan antibody (43DAG1/8D5) | Leica Biosystems | B-DG-CE | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| Peroxidase AffiniPure Donkey anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 715-035-150 | |
| Peroxidase AffiniPure Goat anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-045 | |
| Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Gibco/Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | |
| Reduced glutathione | Sigma-Aldrich | G6529 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Sigma-Aldrich | 862010 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Streptavidin agarose resin | Thermo Fisher Scientific | #20347 | |
| Rabbit polyclonal anti-AQP4 antibody | Alomone | AQP-004 | |
| Tris base (Trizma base) | Fisher Scientific | BP152-1 | |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | BP153-1 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 |
References
- Baskin, G., Schenker, S., Frosto, T., Henderson, G. Transforming growth factor beta 1 inhibits epidermal growth factor receptor endocytosis and down-regulation in cultured fetal rat hepatocytes. J Biol Chem. 266 (20), 13238-13242 (1991).
- Hazum, E., Cuatrecasas, P., Marian, J., Conn, P. M. Receptor-mediated internalization of fluorescent gonadotropin-releasing hormone by pituitary gonadotropes. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (11), 6692-6695 (1980).
- Hemmaplardh, D., Morgan, E. H. Transferrin uptake and release by reticulocytes treated with proteolytic enzymes and neuraminidase. Biochim Biophys Acta. 426 (3), 385-398 (1976).
- Katsura, T., et al. Constitutive and regulated membrane expression of aquaporin 1 and aquaporin 2 water channels in stably transfected LLC-PK1 epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (16), 7212-7216 (1995).
- Li, Y., Cam, J., Bu, G. Low-density lipoprotein receptor family: endocytosis and signal transduction. Mol Neurobiol. 23 (1), 53-67 (2001).
- Gyorgy, P., Melville, D. B., Burk, D., Du Vigneaud, V. The possible identity of vitamin H with biotin and coenzyme R. Science. 91 (2358), 243-245 (1940).
- Cole, S. R., Ashman, L. K., Ey, P. L. Biotinylation: an alternative to radioiodination for the identification of cell surface antigens in immunoprecipitates. Mol Immunol. 24 (7), 699-705 (1987).
- Green, N. M. Avidin 1. the use of [14-C]biotin for kinetic studies and for assay. Biochem J. 89 (3), 585-591 (1963).
- Korpela, J. Avidin, a high affinity biotin-binding protein, as a tool and subject of biological research. Med Biol. 62 (1), 5-26 (1984).
- Li, Y., et al. Imaging pHluorin-tagged receptor insertion to the plasma membrane in primary cultured mouse neurons. J Vis Exp. (69), e4450 (2012).
- Soohoo, A. L., Bowersox, S. L., Puthenveedu, M. A. Visualizing clathrin-mediated endocytosis of G protein-coupled receptors at single-event resolution via TIRF microscopy. J Vis Exp. (92), e51805 (2014).
- Noel, G., Tham, D. K., Moukhles, H. Interdependence of laminin-mediated clustering of lipid rafts and the dystrophin complex in astrocytes. J Biol Chem. 284 (29), 19694-19704 (2009).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Madrid, R., et al. Polarized trafficking and surface expression of the AQP4 water channel are coordinated by serial and regulated interactions with different clathrin-adaptor complexes. EMBO J. 20 (24), 7008-7021 (2001).
- Tham, D. K., Joshi, B., Moukhles, H. Aquaporin-4 Cell-Surface Expression and Turnover Are Regulated by Dystroglycan, Dynamin, and the Extracellular Matrix in Astrocytes. PLoS One. 11 (10), 0165439 (2016).
