In Vivo Darstellung der Cx3cr1GLP/Gfp Reporter Mäuse mit Spectral-Domain optische Kohärenztomographie und Scanning Laser Ophthalmoskopie
Summary
Dieses Protokoll beschreibt wie hochauflösende bildgebende Verfahren wie spectral-Domain optische Kohärenztomographie und scanning Laser Ophthalmoskopie in kleine Nagetiere, mit einer ophthalmologischen Bildgebung Plattform-System, um Auskunft über genutzt werden Netzhautdicke und Microglial Zelle Verteilung, beziehungsweise.
Abstract
Spectral-Domain optische Kohärenztomographie (SD-OCT) und scanning Laser Ophthalmoskopie (SLO) werden ausführlich in experimentelle Ophthalmologie eingesetzt. In diesem Protokoll, Mäuse, die mit dem Ausdruck grün fluoreszierenden Proteins (Gfp) unter den Promotor des Cx3cr1 (BALB/c-Cx3cr1GLP/GLP) wurden verwendet, um Bild-Mikroglia Zellen in Vivo in der Netzhaut. Mikroglia sind resident Makrophagen der Netzhaut und haben verschiedene Netzhauterkrankungen1,2,3,4,5,6in Verbindung gebracht. Dieses Protokoll bietet einen detaillierten Ansatz zur Erzeugung von retinalen B-Scans, mit SD-OCT und Bildgebung der Mikroglia Zelle Verteilung in Cx3cr1GLP/Gfp Mäuse mit SLO in Vivomit einer ophthalmologischen Bildgebungssystem Plattform. Das Protokoll kann in mehrere Reporter Mauslinien verwendet werden. Es gibt jedoch einige Einschränkungen des Protokolls, die hier vorgestellt. Erstens, SLO und SD-OCT, im hochauflösenden Modus, sammeln von Daten mit hohe axiale Auflösung aber die laterale Auflösung ist geringer (3,5 µm und 6 µm, beziehungsweise). Darüber hinaus ist die Fokus und Sättigung Ebene in SLO hängt stark von Parameter-Auswahl und korrekte Ausrichtung des Auges. Zusätzlich, im Vergleich mit Geräten, die für menschliche Patienten bei Mäusen ist schwierig wegen der höheren optischen Gesamtleistung des Auges Maus entworfen für das menschliche Auge; kann dies um zu lateralen Vergrößerung Ungenauigkeiten7, die auch die Vergrößerung durch die Maus Linse u.a. abhängig sind. Jedoch trotz, die position der axiale Scan ist abhängig von lateralen Vergrößerung, die axialen SD-OCT Messungen sind genaue8.
Introduction
In experimentelle Ophthalmologie Untersuchung der Netzhaut Pathologie mit histologischen Techniken in der Regel ausgewertet. Jedoch Histologie erfordert tierischen Euthanization und Änderung der tatsächlichen Eigenschaften des Gewebes verursachen. SD-OCT und SLO werden routinemäßig in der klinischen Ophthalmologie zu diagnostischen Zwecken und für die Überwachung von mehreren Netzhauterkrankungen wie diabetischen Makulaödems9, anteriore ischämische optische Neuropathie10oder Retinitis Pigmentosa11 verwendet . SD-OCT und SLO sind nicht-invasive Techniken, die hochauflösende Bilder von der Netzhaut zu erzeugen, die durch den erweiterten Pupille ohne weiteres Zutun visualisiert werden. SD-OCT informiert der Netzhaut Struktur und Netzhautdicke Datensammlung Photons um Schnittbilder der Netzhaut zu erstellen, während SLO Fluoreszenz Daten sammelt um stereoskopische kontrastreiche Bilder der Netzhaut zu erzeugen. Heute, beide Techniken werden zunehmend in experimentelle Ophthalmologie mit kleinen Nagetieren12,13,14,15 (oder sogar Zebrafisch16,17) verwendet und können bieten Sie sowohl qualitative und quantitative Informationen12,17,18,19,20,21.
Ansammlung von endogenen Fluorophore wie Lipofuscins oder die Bildung von Drusen in der Netzhaut kann durch SLO als Auto Fluoreszenzsignal visualisiert werden. Diese Eigenschaft macht SLO eine wertvolle Technik zur Diagnose und Überwachung von Netzhauterkrankungen wie altersbedingte Makula-Degeneration oder Retinitis Pigmentosa22,23. In experimentelle Ophthalmologie kann Auto-Fluoreszenz-imaging (AF) zur Erkennung von bestimmten Zelltypen Reporter Mauslinien verwendet werden. Zum Beispiel sind Mäuse heterozygot für die Ausprägung der Gfp unter den Promotor des Cx3cr124 vorteilhaft für in Vivo Visualisierung der Mikroglia-Zellen in die normale Netzhaut und zur Untersuchung der Mikroglia/Makrophagen Dynamik in Netzhauterkrankung21. Mikroglia sind die ansässigen Makrophagen der Netzhaut, die eine entscheidende Rolle spielen auf Gewebe Homöostase und Gewebereparatur bei Verletzung1,25,26. Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut berichtet in der Netzhaut Verletzung, Ischämie und Degeneration, was eine Rolle dieser Zellen im Netzhauterkrankung2,3,4,5, 6.
Ziel dieses Protokolls ist es, eine relativ einfache Methode zur retinale Bildgebung und Messung der Netzhautdicke mit SD-OCT und zur Visualisierung der Gfp positive Mikroglia Zellen in den Cx3cr1GLP/Gfp Netzhaut Maus beschreiben SLO (Heidelberg Spectralis HRA + OCT-System). Dieses Protokoll kann für Bildgebung und Dicke Messungen des gesunden oder Kranken retinae in verschiedenen Mauslinien genutzt werden. Darüber hinaus können morphometrische Analysen zur Identifizierung und Quantifizierung der Mikroglia Zahlen und Mikroglia-Aktivierung in der Netzhaut mit SLO21durchgeführt werden. Mikroglia-Zellen sind mit degenerativen Erkrankungen in das zentrale Nervensystem (ZNS), einschließlich der Netzhaut27,28,29verbunden. So durch die Kombination der beiden Methoden verwendet in diesem Protokoll, Korrelation der Mikroglia Verbreitung und Degeneration der Netzhaut kann vorgenommen werden, die Überwachung Krankheitschwierigkeit erleichtern kann, oder die Wirksamkeit der therapeutischen Ansätze in Vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der vorliegende Artikel zeigt ein Protokoll für den Erwerb von retinalen B-Scans und Bildgebung der Gfp positive Mikroglia Verteilung in der Maus Netzhaut in der gleichen Sitzung imaging. SD-OCT und SLO werden zunehmend in Tiermodellen der Netzhauterkrankung zur retinalen Veränderungen über Zeit10,14,17,18,21informieren. Mit diesem Protokoll, Cx3cr1<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Stipendium des Schweizerischen Nationalfonds (SNF; #320030_156019). Die Autoren erhielten nichtfinanzielle Unterstützung von Heidelberg Engineering GmBH, Deutschland.
Materials
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
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