Vivo에서 스펙트럼-도메인 광학 일관성 단층 촬영 스캐닝 레이저 Ophthalmoscopy와 Cx3cr1gfp/gfp 기자 쥐의 이미징
Summary
이 프로토콜 스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 등 어떻게 고해상도 이미징 기술을 설명 하 고 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy에 정보를 얻기 위해 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하 여 작은 설치류에 이용 될 수 있다 망막 두께 microglial 각각 유통, 셀.
Abstract
스펙트럼 도메인 광학 일관성 단층 촬영 (SD-10 월) 및 스캐닝 레이저 ophthalmoscopy (SLO) 실험 안과에 광범위 하 게 사용 됩니다. 현재 프로토콜에서 마우스 표현 녹색 형광 단백질 (gfp) Cx3cr1 의 발기인에서 (BALB/c-Cx3cr1gfp/gfp) microglia 세포에서 vivo에서 망막에 이미지를 사용 했다. Microglia 상주 세포는 망막의 고 여러 망막 질환1,2,3,4,,56에 연루 되었습니다. 이 프로토콜의 망막 B-스캔, SD-10 월과 SLO에서 vivo에서,와 함께 Cx3cr1gfp/gfp 마우스 microglia 셀 배포판의 이미징 안과 이미징 플랫폼 시스템을 사용 하는 세대에 대 한 상세한 접근을 제공 합니다. 프로토콜은 여러 기자 마우스 라인에서 사용할 수 있습니다. 그러나, 여기에 제시 된 프로토콜 몇 가지 제한이 있습니다. 첫째, SLO 및 SD-10 월, 고해상도 모드에서 사용 될 때 높은 축 해상도 측면 해상도와 데이터 수집 낮습니다 (3.5 µ m와 6 µ m, 각각). 또한, SLO에 초점 및 채도 수준을 높은 매개 변수 선택 및 눈의 올바른 정렬에 의존 합니다. 또한, 인간의 눈;에 비해 쥐에서 인간 환자는 마우스 눈의 더 높은 총 광학 힘 인 도전 위해 고안 된 장치를 사용 하 여 이 또한 다른 사람의 사이에서 마우스 렌즈에 의해 확대에 따라 확대 부정확7, 측면을 발생할 수 있습니다. 그러나, 축 검사 위치에 불구 하 고 측면 배율에 따라 달라 집니다, 그리고 축 SD 10 월 측정은 정확 하 게8.
Introduction
실험적인 안과에서 망막 병 리의 검사 일반적으로 조직학 기술을 사용 하 여 평가 합니다. 그러나, 조직학 동물 euthanization를 요구 하 고 조직의 실제 속성 변경 발생할 수 있습니다. SD-10 월과 SLO 정기적으로 사용 됩니다 임상 안과에서 진단 목적을 위해 여러 망막 질환 당뇨 황 반 부 종9, 앞쪽 허 혈 성 시 신경 병10또는 망막 화11 등의 모니터링 . SD-10 월과 SLO 추가 개입 없이 넓혀 진된 눈동자를 통해 시각화 되는 망막의 고해상도 이미지를 생성 하는 비-침략 적 기술이 있습니다. SD-10 월 SLO 입체 이미지는 망막의 생산 형광 데이터를 수집 하는 동안 망막의 단면 이미지를 만들려고 backscattering 데이터를 수집 하 여 망막 구조와 망막 두께의 정보를 제공 합니다. 요즘, 모두는 점점 작은 설치류12,13,,1415 (또는 심지어 zebrafish16,17)를 사용 하 여 실험 안과에서 사용 기술과 수 있습니다. 모두 질적 및 양적 정보12,,1718,,1920,21을 제공 합니다.
Lipofuscins 같은 내 생 fluorophores의 축적 또는 망막에 드루의 형성 자동 형광 신호 SLO에 의해 구상 될 수 있다. 이 특징은 SLO 진단 및 연령 관련 황 반 변성 등 망막 화22,23망막 질병의 모니터링을 위한 귀중 한 기술. 실험적인 안과에 자동 형광 이미징 (AF) 기자 마우스 라인에서 특정 세포 유형의 탐지에 대 한 사용할 수 있습니다. 예를 들어 마우스 Cx3cr124 의 발기인에서 gfp의 표현을 위한 heterozygous microglia/대 식 세포의 수사를 위해 정상적인 망막에 microglial 세포의 생체 내에서 시각화 한 유리는 망막 질병21역학입니다. Microglia는 조직의 항상성 및 부상1,,2526시 조직 복구에 중요 한 역할을 하는 망막의 상주 대 식 세포는. Microglia 활성화는 망막에 허 혈, 망막 부상과 변성, 망막 질병2,3,,45, 에서이 세포의 역할을 제안 보고 되었습니다. 6.
현재의 프로토콜의 목적은 망막 이미징 및 SD-10 월를 사용 하 여 망막 두께의 측정에 대 한 사용 하 여 Cx3cr1gfp/gfp 마우스 망막 gfp 긍정적인 microglia 셀의 시각화를 위한 비교적 간단한 방법 설명 하는 SLO (하이델베르크 Spectralis HRA + 10 월 시스템). 이 프로토콜은 다양 한 마우스 라인에서 건강 또는 질병 망막의 이미징 및 두께 측정을 위해 활용할 수 있습니다. 또한, 형태학 분석 식별 및 정량화 microglia 숫자 및 SLO21을 사용 하 여 망막에 microglia 활성화에 대 한 수행할 수 있습니다. Microglia 세포 망막27,,2829를 포함 하 여 중앙 신경 시스템 (CNS)에 퇴행 성 질환과 연결 됩니다. 따라서, 현재 프로토콜에서 사용 하는 두 가지 방법을 조합 하 여 microglia 유통 및 망막 변성의 상관 관계 만들 수 있는 모니터링 질병의 심각도 촉진할 수 있다 또는 vivo에서접근의 치료 효과.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 문서에서는 망막 B-스캔의 수집과 같은 이미징 세션에서 마우스 망막에 gfp 긍정적인 microglia 분포의 이미징에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. SD-10 월과 SLO는 점점 사용 망막 질환의 동물 모델에서10,,1417,18,21이상 망막 변경의 정보를 제공 하. 이 프로토콜, Cx3cr1gfp/g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, #320030_156019)의 교부 금에 의해 지원 되었다. 저자는 하이델베르크 엔지니어링 GmBH, 독일에서에서 비재무 지원을 받았다.
Materials
| Spectralis Imaging system (HRA+OCT) | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | ophthalmic imaging platform system |
| Heidelberg Eye Explorer | Heidelberg Engineering, Germany | N/A | Version 1.9.13.0 |
| 78D standard ophthalmic non-contact slit lamp lens | Volk Optical Inc., Ohio, USA | V78C | |
| Spectralis wide angle 55° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50897-002 | |
| ultra widefield 102° lens | Heidelberg Engineering, Germany | 50117-001 | |
| medetomidine hydrochloride 1 mg/mL (Domitor) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | Swissmedic Nr. 50'590 – ATCvet: QN05CM91 | anesthetic/analgesic |
| ketamine 50mg/ml (Ketalar) | Parke-Davis, Zurich, Switzerland | 72276388 | anesthetic |
| tropicamide 0.5% + phenylephrine HCl 2.5% (Augentropfen mix) | ISPI, Bern, Switzerland | N/A | pupil dilation |
| Omnican Insulin-50 0.5 ml G30 0.3 x 12mm | B. Braun Mesungen AG, Carl-Braun-Straße, Germany | 9151125 | |
| hydroxypropylmethylcellulose (Methocel 2%) | OmniVision, Neuhausen, Switzerland | N/A | |
| +4 dpt rigid gas permeable contact lens | Quantum I, Bausch + Lomb Inc., Rochester, NY | N/A | Base Curve: 7.20 to 8.40 mm Diameter: 9.00 / 9.60 / 10.20 mm Power: -25.00 to +25.00 Diopters |
| balanced salt solution (BSS) | Inselspital, Bern, Switzerland | N/A | |
| silicon forceps | N/A | N/A | |
| atipamezole 5 mg/mL (Antisedan) | Provet AG, Lyssach, Switzerland | N/A | α2 adrenergic receptor antagonist |
| GraphPad Prism 7 | GraphPad Software, Inc, San Diego, CA, USA | N/A | statistical analysis software |
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