Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

Summary

Nous décrivons les modalités et les stratégies pour mesurer les propriétés mécaniques et les voies qui se déroule mécaniques unique de molécules de protéines à l’aide d’un microscope à force atomique. Nous montrons également des résultats représentatifs comme référence pour la sélection et la justification des enregistrements de molécule de protéine seule bonne.

Abstract

La détermination du processus de pliage des protéines de leur séquence d’acides aminés à leur structure 3D natif est un problème important en biologie. Microscopie à force atomique (AFM) peut résoudre ce problème en activant le stretching et relaxation unique de molécules de protéines, ce qui donne une preuve directe de dépliage et repliement des caractéristiques spécifiques. Axée sur l’AFM molécule unique force-spectroscopie (AFM-SMF) fournit un moyen de mesurer systématiquement des conformations à haute énergie dans les protéines qui ne sont pas possibles dans les mesures (biochimique) traditionnelles en vrac. Bien que de nombreux articles ont été publiés pour montrer les principes de l’AFM-SMF, il n’est pas facile de mener des expériences de SMF en raison du manque d’un protocole complet de manière exhaustive. Dans cette étude, nous illustrer brièvement les principes de l’AFM et largement en détail les protocoles, procédures et analyse de données comme guide pour obtenir de bons résultats d’expériences de SMF. Nous démontrons des résultats représentatifs de SMF de mesures déroulement mécanique seule protéine et nous fournissons dépannage couramment les stratégies pour certains des problèmes rencontrés.

Introduction

Les progrès en spectroscopie de force seule molécule (SMF) par AFM ont permis manipulation mécanique et une caractérisation précise des molécules de protéine unique. Cette qualification a produit de nouveaux aperçus sur la protéine mécanique^1,2, protéine pliante³, interactions de protéine-ligand⁴, interactions de protéine-protéine⁵, et à base de protéines usinées matériaux^6,7,8. SMF est particulièrement utile pour l’étude des protéines qui se déroulent, comme s’étendant de l’AFM permet les liaisons chimiques et physiques au sein de la molécule de protéine à étendre progressivement selon leur rigidité, qui donne lieu à une longueur de contour sans cesse croissante. Cette insuffisance d’une molécule de protéine peut produire une transition abrupte dans la courbe force-extension résultant en un cas de rupture (ou pic de force). Le pic de force donne des informations directes sur le changement de force et de la structure qui se déroule de la protéine pendant le processus de déroulement mécanique. Une des premières études à l’aide de AFM mesurée Titine¹ et trouvé de nouveaux aspects de la protéine se déroule et repliement dans des conditions physiologiques sans l’utilisation de dénaturants contre naturels comme produits chimiques concentrés ou des températures extrêmes.

SMF s’expérimente sur une variété d’instruments, bien qu’ici, nous ne considérons que l’AFM. L’AFM se compose de quatre éléments principaux : la sonde du détecteur, le porte-échantillon et le scanner piézoélectrique. La sonde est un bout pointu du côté oscillant du bras de levier. Après calibration, flexion du levier pendant l’étirement d’une molécule attachée est mesurée à l’aide d’un faisceau laser qui se reflète sur le dos du levier pour déterminer précisément les forces à l’aide de la loi de Hooke. Les projets de faisceau laser réfléchi dans un détecteur de photodiode de quadrant qui produit une tension proportionnelle au déplacement du faisceau laser depuis le centre de la diode. Le substrat avec l’échantillon de protéine dans le liquide est monté sur une scène piézoélectrique 3D qui peut être contrôlée avec précision nanométrique subsidiaire. Un ordinateur lit la tension provenant des détecteurs photodiode et contrôle la scène 3D grâce à une source de tension contrôlée par ordinateur. Ces étapes d’actionneur piezo sont habituellement équipées capacitif ou jauge de contrainte-capteurs de position précisément les déplacements de piezo mesure et hystérésis correcte par le biais de système de contrôle des informations en retour. La sortie de signal du capteur du contrôleur piezo est convertie en distance à l’aide de la constante de tension de la piézo qui est calibré en usine. Une courbe de force-extension d’exemple d’une expérience de traction est illustrée à la Figure 2.

Il existe deux types d’expériences de l’AFM-SMF : vitesse constante et force constante tirant sur mesures. Les mesures de force constante SMF sont décrites dans Oberhauser et al. ⁹, alors qu’ici nous nous concentrons sur les mesures de la constante de vitesse. Une expérience traction constante vitesse typique de AFM se faite en fournissant la tension d’un piezo à déplacer doucement un substrat par rapport à une pointe en porte-à-faux. Une expérience typique a la pointe d’abord entrer en contact avec la surface. La mesure de traction est commencée en déplaçant le substrat de la pointe pour faire sortir le contact. Si une protéine vient en contact avec la pointe au départ, il sera tiré et on mesurera la trace qui se déroule de la force contre les déplacements. Le substrat est ensuite ramené le bout et une trace de détente est mesurée où le repliement des protéines peut être déterminé par la force de déplacement.

Protocol

1. préparation de protéines Clonage d’ADN. Synthétiser une séquence d’ADN d’intérêt, par exemple, la séquence d’ADN de NI10C10, ou isoler par PCR de l’organisme hôte à l’aide de techniques de la biologie moléculaire standard11. Flanquent le gène d’intérêt avec des sites de restriction pendant la synthèse, soit en plaçant des sites à l’extrémité 5′ des amorces PCR correspond à un module dans le plasmide…

Representative Results

Des résultats représentatifs de ce protocole sont indiquées à la Figure 2. Les deux panneaux montrent les courbes représentant force-extension des protéines. Du haut montre les résultats d’une polyprotéine I91, tandis que la partie inférieure montre la protéine I91 flanquant un protéine d’intérêt, la molécule de10C NI. Ces enregistrements montrent la force caractéristique du I91 (réf 200) et augmentation de longueur de contour (…

Discussion

Une étape cruciale dans le protocole est l’utilisation d’une polyprotéine, décrit à l’étape 1.1.2, qui sert de témoin positif à « l’empreinte » événements de molécules simples. Généralement, il doit être déroulement des événements de la polyprotéine de protéines (pour I91, cela signifie une force qui se déroule d’environ 200 pN et contour accroissement en longueur d’environ 28 nm) de conclure sans ambiguïté que la protéine d’intérêt a été dévoilée. Par exemple, lorsque la pro…

Materials

AFM Specimen Discs, 15mm diameter	Ted Pella, Inc.	16218	Serve as base for glass substrate
Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick	Ted Pella, Inc.	26024	serve as glass substrate and base for gold coating
Adhesive Tabs	Ted Pella, Inc.	16079	Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips
STD Multimode head assembly	Bruker Nano Inc.	1B75C	AFM head
Glass probe holder	Bruker Nano Inc.	MTFML-V2	Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM.
Microlever AFM probes	Bruker Nano Inc.	MLCT	Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes
AFM probes with Au coated tips	Bruker Nano Inc.	OBL-10	Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force
Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs	National Instruments	PCI-6259	Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators
LISA Linear Piezo Stage Actuators	Physik Instrumente LP	P-753.11C	Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements
XY Piezo Stage	Physik Instrumente LP	P-541.2CD	Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface