Kraft-Spektroskopie einzelner Proteinmoleküle, die mit einem Rasterkraftmikroskop
Summary
Wir beschreiben die detaillierte Verfahren und Strategien zur Messung der mechanischen Eigenschaften und mechanische entfaltenden Wege der einzelnen Protein-Moleküle mit einem Rasterkraftmikroskop. Wir zeigen auch repräsentative Ergebnisse als Referenz für die Auswahl und Begründung der gute einzelne Protein-Molekül-Aufnahmen.
Abstract
Die Bestimmung der Faltvorgang von Proteinen aus ihrer Aminosäure-Sequenz in ihrer nativen 3D Struktur ist ein wichtiges Problem in der Biologie. Rasterkraftmikroskopie (AFM) kann dieses Problem anzugehen, indem Dehnung und Lockerung der einzelne Proteinmoleküle, die direkte Beweise für bestimmte Entfaltung und Umfaltung Eigenschaften gibt. AFM-basierte Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie (AFM-SMFS) bietet die Möglichkeit, energiereiche Konformationen an Proteinen konsequent zu messen, die in traditionellen Bulk (biochemische) Messungen nicht möglich sind. Obwohl zahlreiche Arbeiten veröffentlicht wurden, um die Prinzipien der AFM-SMFS zeigen, ist es nicht einfach, SMFS Experimente aufgrund mangelnder ein ausführlich vollständiges Protokoll durchzuführen. In dieser Studie wir kurz erläutern die Prinzipien der AFM und ausführlich detailliert die Protokolle, Verfahren und Datenanalyse als Leitlinie zu guten Ergebnissen aus SMFS Experimenten. Wir zeigen repräsentative SMFS Messergebnisse einziges Protein mechanische Entfaltung und wir bieten Fehlerbehebung Strategien für einige häufig Probleme.
Introduction
Fortschritte in der Einzelmolekül-Kraft-Spektroskopie (SMF) von AFM haben mechanische Manipulation und präzise Charakterisierung der einzelnen Proteinmoleküle ermöglicht. Diese Charakterisierung hat neue Einblicke über Protein Mechanik1,2,3, Protein-Ligand-Interaktionen4, Proteinprotein Interaktionen5, Faltung von Proteinen und Protein-basierten entwickelt Materialien6,7,8. SMFS eignet sich besonders für die Untersuchung von Protein entfaltet, als Dehnung von AFM ermöglicht die chemischen und physikalischen Bindungen innerhalb das Eiweißmolekül allmählich nach ihrer Steifigkeit, erweitern die Anlass zu einer ständig zunehmenden Kontur Länge. Diese Überdehnung der ein Eiweißmolekül kann produzieren einen abrupten Übergang in der Kraft-Verlängerung-Kurve, wodurch ein Bruch-Ereignis (oder zwingen Peak). Die Kraft-Gipfel gibt direkte Informationen über die sich entfaltende Kraft und strukturelle Veränderung des Proteins bei der mechanischen Entfaltung. Eine der ersten Studien mit AFM Titin1 gemessen und neuartige Aspekte des Proteins Entfaltung und Umfaltung unter physiologischen Bedingungen ohne den Einsatz von unnatürlichen Denaturierungsmittel wie konzentrierte Chemikalien oder extremen Temperaturen zu finden.
SMFS Experimente sind auf eine Vielzahl von Instrumenten, obwohl hier wir nur die AFM betrachten. Die AFM besteht aus vier Hauptelemente: die Sonde, der Detektor, der Probenhalter und der piezoelektrischen Scanner. Die Sonde ist eine scharfe Spitze auf die freischwingende Ende ein Freischwinger. Nach der Kalibrierung wird Biegung des Nadelträgers während Dehnung eines angeschlossenen Moleküls gemessen mit Hilfe eines Laserstrahls, das sich auf der Rückseite des Nadelträgers Kräfte mit Hooke Gesetz genau zu bestimmen widerspiegelt. Die reflektierten Laser Beam Projekte in einem Quadranten Photodiode Detektor erzeugt eine Spannung im Verhältnis zu der Verschiebung des Laserstrahls von der Mitte der Diode. Das Substrat mit der Protein-Probe in Flüssigkeit ist eine 3D piezoelektrischen Bühne montiert, die mit Sub-Nanometer-Präzision gesteuert werden kann. Ein Computer liest die Spannung der Photodiode Detektoren und steuert die 3D Bühne durch eine computergesteuerte Versorgungsspannung. Diese Piezo-Aktor-Phasen sind in der Regel ausgestattet mit kapazitiven oder DMS-Positionssensoren genau messen Piezo Verschiebung und korrekte Hysterese durch Feed-Back Kontrollsystem. Der Sensor Signalausgang aus der Piezo-Steuerung wird in Entfernung mit der Spannung konstante Piezo, die werkseitig kalibriert ist umgewandelt. Eine Beispiel Kraft-Verlängerung Kurve von einem ziehen Experiment ist in Abbildung 2dargestellt.
Es gibt zwei Arten von AFM-SMFS Experimente: konstante Geschwindigkeit und konstante Kraft ziehen Messungen. Konstante Kraft SMFS Messungen werden im Oberhauser Et Al. beschrieben. 9, während hier wir uns auf konstanter Geschwindigkeitsmessungen konzentrieren. Ein typisches AFM konstante Geschwindigkeit Ziehens Experiment erfolgt durch die Bereitstellung von Spannung an einen Piezo, ein Substrat im Verhältnis zu einem Freischwinger-Tipp sanft zu bewegen. Ein typisches Experiment hat die Spitze zunächst gegen die Oberfläche drücken. Die ziehende Messung wird begonnen, durch Verschieben des Substrats von der Spitze aus Kontakt zu bringen. Wenn ein Protein in Kontakt mit der Spitze zuerst kommt, wird eingezogen und die sich entfaltenden Spur von Gewalt gegen Verschiebung gemessen werden. Das Substrat wird dann wieder in Kontakt mit der Spitze gebracht und eine entspannende Spur wird gemessen, wo die Proteinfaltung aus der Kraft-Weg ermittelt werden kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein entscheidender Schritt im Protokoll ist die Verwendung eines funkionalen, beschrieben in Schritt 1.1.2, dient als Positivkontrolle Einzelmolekül-Veranstaltungen “Fingerabdrücke”. In der Regel, es muss sein Entfaltung Ereignisse der funkionalen Proteine (für I91, bedeutet dies eine sich entfaltende Kraft von etwa 200 pN und Kontur Länge Inkrement von etwa 28 nm) eindeutig feststellen, dass das Protein des Interesses entfaltet worden ist. Zum Beispiel wenn das Protein des Interesses von drei I91 Domänen von beiden…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Science Foundation Stipendien MCB-1244297 und MCB-1517245, PEM unterstützt.
Materials
| AFM Specimen Discs, 15mm diameter | Ted Pella, Inc. | 16218 | Serve as base for glass substrate |
| Round Glass Coverslips, 15mm diamiter No.1 Thick | Ted Pella, Inc. | 26024 | serve as glass substrate and base for gold coating |
| Adhesive Tabs | Ted Pella, Inc. | 16079 | Paste on AFM Specimen Discs to provide a sticky face for attaching glass coverslips |
| STD Multimode head assembly | Bruker Nano Inc. | 1B75C | AFM head |
| Glass probe holder | Bruker Nano Inc. | MTFML-V2 | Glass probe holder for scanning in fluid with the MultiMode AFM. |
| Microlever AFM probes | Bruker Nano Inc. | MLCT | Silicon Nitride cantilevers with Silicon Nitride tips, ideal for contact imaging modes |
| AFM probes with Au coated tips | Bruker Nano Inc. | OBL-10 | Cantilevers for pulling on proteins with low unfolding force |
| Multifunction Data Acquisition (DAQ) Card,16-Bit, 1 MS/s (Multichannel), 1.25 MS/s (1-Channel), 32 Analog Inputs | National Instruments | PCI-6259 | Data Acquisition for signals from AFM head and Piezo Actuators |
| LISA Linear Piezo Stage Actuators | Physik Instrumente LP | P-753.11C | Piezo Actuator to control the position of substrate and perform pulling measurements |
| XY Piezo Stage | Physik Instrumente LP | P-541.2CD | Piezo Actuator to control the position of substrate and scan on substrate surface |
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