Meget multiplexeret, superopløselig billeddannelse af T-celler ved hjælp af madSTORM
Summary
Vi demonstrerer en metode til at vise flere molekyler inden for heterogene nanostrukturer ved nøjagtighed af enkeltmolekyler ved hjælp af sekventiel binding og eluering af fluorescensmærkede antistoffer.
Abstract
Imaging heterogene cellulære strukturer ved anvendelse af enkeltmolekyl lokalisering mikroskopi er blevet forhindret af utilstrækkelig lokalisering præcision og multiplexing evne. Ved hjælp af fluorescerende nano-diamant fiducial markører beskriver vi driftskorrektions- og justeringsprocedurerne, der kræves for at opnå høj præcision i enkeltmolekyle lokaliseringsmikroskopi. Derudover er der beskrevet en ny multiplexeringsstrategi, madSTORM, hvori flere molekyler er målrettet i den samme celle ved anvendelse af sekventiel binding og eluering af fluorescerende antistoffer. MadSTORM er demonstreret på en aktiveret T-celle for at visualisere placeringen af forskellige komponenter i en membranbundet, multi-proteinstruktur kaldet T-cellereceptor-mikroklassen. Derudover er anvendelsen af madSTORM som et generelt værktøj til visualisering af multi-proteinstrukturer diskuteret.
Introduction
En række superopløsningsmikroskopiteknikker er blevet udviklet til at overvinde diffraktionsgrænsen for lysmikroskopi (~ 200 nm). Blandt disse er en kategori af teknikker kaldet single molecule localization microscopy (SMLM), som omfatter fotoaktivering lokalisering mikroskopi (PALM) og stokastisk optisk rekonstruktion mikroskopi (STORM). SMLM teknikker deler i brugen af fluoroforer, der kan skiftes mellem på (fluorescerende) og off (mørke / foto-switchede) tilstande, hvilket muliggør sekventiel lokalisering af fluorescens fra enkeltmolekyler 1 , 2 , 3 .
På grund af dets kompatibilitet med kommercielt tilgængelige farvestoffer og mikroskoper er direkte STORM (dSTORM) blevet en almindeligt vedtaget SMLM-teknik 4 . DSTORM kan rutinemæssigt opnå ~ 10 nm lokaliseringspræcision, defineret som usikkerheden ved beregning af centrum for en diffraktionIonbegrænset punktspredningsfunktion (PSF). På trods af den høje præcision, der anslås ved hjælp af lokaliseringsalgoritmerne 5 , 6 , 7 , er nøjagtig bestemmelse af den faktiske placering af enkeltmolekyler blevet hæmmet af en række problemer. For det første tilføjer mekanisk bevægelse af mikroskopfasen under billedopsamling betydelig usikkerhed omkring lokaliseringspræcision. Da SMLM-billeder opnås over tusindvis af tidsrammer, kan nano-skala bevægelser i mikroskopetrinnet betydeligt kompromittere præcisionen af det endelige superopløsningsbillede 8 . For at kompensere for trinbevægelse under billedkøb, estimeres scenydrift almindeligvis fra regressionsbaseret montering af in-situ lokaliseringer fra selve billedet (krydskorrelation) eller sekventielle lokaliseringer fra fiducial-markører (fiducial-korrektion) 1 , 9 . HowevEr, disse metoder kræver optimering af flere parametre for hver billedstabel og kan ikke tage højde for scenebevægelser på kort tidskalaer som mekanisk vibration. Guldnano-partikler og flerfarvede fluorescerende perler er blevet anvendt som fiducial markører i SMLM, men de er ikke fotostabile og resulterer i signifikant lavere præcision efter driftskorrektion end nitrogen fluorescerende nanodiamanter (FND'er) I madSTORM 10 .
Ud over diffraktionsgrænsen er lysmikroskopi yderligere begrænset af spektrale grænser. Samtidig visualisering af flere mål kræver fluorescerende sonder med ikke-overlappende spektrale profiler, der generelt begrænser fluorescensbaseret lysmikroskopi til 6 farver og SMLM til 2-3 farver 4 , 11 , 12 . Desuden forårsager ikke-lineær kromatisk afvigelse forskydning af flerfarvede billeder, wDer kræver omfattende justeringsprocedurer ved brug af flerfarvede fiducial markører 8 , 13 . For at overvinde disse grænser har tidligere undersøgelser afbildet flere mål ved anvendelse af gentagen fotoblegning eller kemisk quenching af sekventielt bundne fluoroforer 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 . Selvom disse fremgangsmåder kan overvinde mikroskopiens spektrale grænser, er fluorescensblegning kendt for at være en toksisk proces 20 , og langvarig blegning eller slukning kan forårsage uønskede bivirkninger såsom tab af tværbinding. Desuden kan akkumuleringen af fluorescerende prober føre til sterisk blokering af bindingssteder i prøven, hvilket forhindrer storskala multiplexering og robust målretning af epitoper. For at undgå sådan sterisk indblanding er en nylig sTudy opnået multipleksering ved anvendelse af stokastisk udveksling af frit diffunderende proteinfragmenter 21 . Mens denne metode tillader tæt mærkning af cellulære strukturer, kræver det omfattende biokemisk præparation til isolering af peptidfragmenter, kan ikke lokalisere enkeltmolekylpositioner og letter ikke let ved hjælp af storskala multiplexering ved anvendelse af kommercielt tilgængelige prober. Vi præsenterer en detaljeret videoprotokol, der beskriver sekventiel binding og eluering af fluorescensantistoffer til multiplexeret, antistofstørrelsesbegrænset dSTORM (madSTORM) billedbehandling og anvendelse af fluorescerende nanodiamanter for at opnå præcis driftskorrektion og justering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den sekventielle multiplexering, driftskorrektion og justeringsprocedurer i madSTORM tillader præcis, højmultiplexeret visualisering af heterogene strukturer i celler. 10 Derudover undgår madSTORM begrænsningerne i multi-farve STORM, såsom kromatisk aberration og suboptimale fotoswitching / emissionsegenskaber af ikke-farfarfarvestoffer 9 , 12 . Da elueringstrinnet signifikant reducerer sterisk interferens fra sekventielt bundne anti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Xufeng Wu for adgang til STORM-mikroskopet. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Programmet fra National Cancer Institute (NCI) Center for Cancer Research og National Heart Lung and Blood Institute (NHLBI).
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
References
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
- Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protoc. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Mortensen, K. I., Churchman, L. S., Spudich, J. A., Flyvbjerg, H. Optimized localization analysis for single-molecule tracking and super-resolution microscopy. Nat Methods. 7 (5), 377-381 (2010).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).
- Rieger, B., Stallinga, S. The lateral and axial localization uncertainty in super-resolution light microscopy. Chemphyschem. 15 (4), 664-670 (2014).
- Pertsinidis, A., Zhang, Y., Chu, S. Subnanometre single-molecule localization, registration and distance measurements. Nature. 466 (7306), 647-651 (2010).
- Bates, M., Jones, S. A., Zhuang, X. Stochastic optical reconstruction microscopy (STORM): a method for superresolution fluorescence imaging. Cold Spring Harb Protoc. (6), 498-520 (2013).
- Yi, J., et al. madSTORM: a superresolution technique for large-scale multiplexing at single-molecule accuracy. Mol Biol Cell. 27 (22), 3591-3600 (2016).
- Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. Multicolor super-resolution imaging with photo-switchable fluorescent probes. Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).
- Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging. Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).
- Erdelyi, M., et al. Correcting chromatic offset in multicolor super-resolution localization microscopy. Opt Express. 21 (9), 10978-10988 (2013).
- Gerdes, M. J., et al. Highly multiplexed single-cell analysis of formalin-fixed, paraffin-embedded cancer tissue. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11982-11987 (2013).
- Jungmann, R., et al. Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT. Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).
- Nanguneri, S., Flottmann, B., Horstmann, H., Heilemann, M., Kuner, T. Three-dimensional tomographic super-resolution fluorescence imaging of serially sectioned thick samples. PLoS One. 7 (5), e38098 (2012).
- Schubert, W., et al. Analyzing proteome topology and function by automated multidimensional fluorescence microscopy. Nat Biotechnol. 24 (10), 1270-1278 (2006).
- Tam, J., Cordier, G. A., Borbely, J. S., Sandoval Alvarez, A., Lakadamyali, M. Cross-talk-free multi-color STORM imaging using a single fluorophore. PLoS One. 9 (7), e101772 (2014).
- Valley, C. C., Liu, S., Lidke, D. S., Lidke, K. A. Sequential superresolution imaging of multiple targets using a single fluorophore. PLoS One. 10 (4), e0123941 (2015).
- Hoebe, R. A., et al. Controlled light-exposure microscopy reduces photobleaching and phototoxicity in fluorescence live-cell imaging. Nat Biotechnol. 25 (2), 249-253 (2007).
- Kiuchi, T., Higuchi, M., Takamura, A., Maruoka, M., Watanabe, N. Multitarget super-resolution microscopy with high-density labeling by exchangeable probes. Nat Methods. 12 (8), 743-746 (2015).
- Campi, G., Varma, R., Dustin, M. L. Actin and agonist MHC-peptide complex-dependent T cell receptor microclusters as scaffolds for signaling. J Exp Med. 202 (8), 1031-1036 (2005).
- Sarkar, S. K., et al. Wide-field in vivo background free imaging by selective magnetic modulation of nanodiamond fluorescence. Biomed Opt Express. 5 (4), 1190-1202 (2014).
