बेहद मल्टीप्लेक्जड, सुपरस्टोयलिंग इमेजिंग टी सेल
Summary
हम अनुक्रमिक बाध्यकारी और फ्लोरोसेंटली लेबल एंटीबॉडी के क्षीणन का उपयोग करते हुए एकल अणु सटीकता पर विषम नैनो-संरचनाओं के भीतर छवि के कई अणुओं को प्रदर्शित करते हैं।
Abstract
एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए विषम सेलुलर संरचनाओं को इमेजिंग अपर्याप्त स्थानीयकरण परिशुद्धता और बहुसंकेतन क्षमता द्वारा बाधित किया गया है। फ्लोरोसेंट नैनो-डायमंड फेड्यूशियल मार्कर का उपयोग करके, हम एक अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी में उच्च सटीकता प्राप्त करने के लिए आवश्यक बहाव सुधार और संरेखण प्रक्रियाओं का वर्णन करते हैं। इसके अलावा, एक नई मल्टीप्लेज़िंग रणनीति, मैडमस्टोरम, को वर्णित किया गया है जिसमें एक ही सेल में कई अणुओं को लक्षित किया जाता है ताकि अनुक्रमिक बाध्यकारी और फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी के क्षीणन का उपयोग किया जा सके। मैथमस्टोरम को एक सक्रिय टी सेल पर प्रदर्शित किया जाता है जिससे टी-सेल रिसेप्टर माइक्रोकोल्स्टर नामक एक झिल्ली-बाध्य, बहु-प्रोटीन संरचना के भीतर विभिन्न घटकों के स्थानों की कल्पना की जाती है। इसके अतिरिक्त, मल्टी-प्रोटीन संरचनाओं के विज़ुअलाइजेशन के लिए सामान्य उपकरण के रूप में मदस्टोरम के आवेदन पर चर्चा की जाती है।
Introduction
प्रकाश माइक्रोस्कोपी (~ 200 एनएम) की विवर्तन सीमा को दूर करने के लिए सुपर-रिज़ोल्यूशन माइक्रोस्कोपी तकनीकों की एक किस्म विकसित की गई है। इनमें से एक एकल तकनीक है, जिसे एकल अणु स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (एसएमएलएम) कहा जाता है, जिसमें फोटो-सक्रियण स्थानीयकरण माइक्रोस्कोपी (पाम) और स्टोचस्टिक ऑप्टिकल पुनर्निर्माण माइक्रोस्कोपी (स्टोर्म) शामिल हैं। एसएमएलएम तकनीकों फ्लोराफोर्स के उपयोग में हिस्सा लेती हैं जो कि (फ्लोरोसेंट) और ऑफ (अंधेरे / फोटो-स्विचेटेड) राज्यों के बीच स्विच की जा सकती हैं, जो एकल अणुओं 1 , 2 , 3 से प्रतिदीप्ति के अनुक्रमिक स्थानीयकरण की अनुमति देता है।
व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रंजक और सूक्ष्मदर्शी के साथ इसकी संगतता के कारण, सीधी STORM (डीएसटीओआरएम) एक व्यापक रूप से अपनाया गया एसएमएलएम तकनीक 4 बन गया है। डीएसटीओआरएम नियमित रूप से ~ 10 एनएम स्थानीयकरण परिशुद्धता प्राप्त कर सकता है, जिसे अंतर के केंद्र की गणना में अनिश्चितता के रूप में परिभाषित किया गया हैआयन-सीमित बिंदु प्रसार समारोह (पीएसएफ) हालांकि, उच्च परिशुद्धता के बावजूद स्थानीयकरण एल्गोरिदम 5 , 6 , 7 का उपयोग करते हुए , कई मुद्दों के द्वारा एकल अणुओं की वास्तविक स्थिति के सटीक निर्धारण को बाधित किया गया है। सबसे पहले, छवि अधिग्रहण के दौरान माइक्रोस्कोप मंच के यांत्रिक आंदोलन स्थानीयकरण परिशुद्धता के लिए महत्वपूर्ण अनिश्चितता कहते हैं। चूंकि एसएमएलएम छवियां हज़ारों समय-सीमाबद्ध फ्रेमों पर प्राप्त होती हैं, सूक्ष्मदर्शी चरण के नैनो पैमाने पर आंदोलनों अंतिम सुपर-रिजोल्यूशन 8 छवि की सटीकता को काफी समझौता कर सकती हैं। इमेज अधिग्रहण के दौरान मंच आंदोलन के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए, स्टेज ड्राफ्ट का आमतौर पर प्रतिबिंब-आधारित फिटिंग का चित्र खुद से (क्रॉस कॉरलेशन) या फेड्यूशियल मार्करों (फ़िड्यूअल सुधार) 1 , 9 के अनुक्रमिक स्थानीयकरण से अनुमान लगाया गया है। Howevएर, इन तरीकों से प्रत्येक छवि स्टैक के लिए कई मापदंडों के अनुकूलन की आवश्यकता होती है, और मैकेनिकल कंपन जैसे कम समय के स्तर पर चरण आंदोलनों के लिए खाता नहीं लगा सकता है। सोना नैनो कण और बहु रंग के फ्लोरोसेंट मोती एसएमएलएम में एफिड्यूशियल मार्कर के रूप में उपयोग किए गए हैं, लेकिन वे फोटो-स्थिर नहीं हैं, और नाइट्रोजन रिक्ति-केंद्र फ्लोरोसेंट नैनो-हीरे (एफडीएस) की तुलना में बहाव सुधार के बाद काफी कम सटीक परिणाम हैं मैडमस्टोर 10 में
विवर्तन सीमा के अलावा, हल्के माइक्रोस्कोपी को वर्णक्रमीय सीमाओं के द्वारा प्रतिबंधित किया जाता है। कई लक्ष्यों के साथ-साथ विज़न को फ्लोरोसेंट जांच की आवश्यकता होती है, गैर-अतिव्यापी वर्णक्रमीय प्रोफाइल, आम तौर पर प्रतिदीप्ति-आधारित प्रकाश माइक्रोस्कोपी को 6 रंगों और एसएमएलएम को 2-3 रंगों 4 , 11 , 12 पर सीमित करता है। इसके अलावा, गैर-रैखिक रंगीन विपथन बहुरंगा छवियों के misalignment का कारण बनता है, डब्ल्यूइस के लिए बहु-रंगीन Fiducial मार्करों 8 , 13 का उपयोग करते हुए व्यापक संरेखण प्रक्रियाओं की आवश्यकता है। इन सीमाओं पर काबू पाने के लिए, पिछले अध्ययनों में दोहराव वाले फोटोबलीचिंग या अनुक्रमिक रूप से बाध्य फ्लोरोफोर्स 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 1 9 की रासायनिक शमन का उपयोग करते हुए कई लक्ष्य बनाए गए हैं। हालांकि ये पद्धति माइक्रोस्कोपी की वर्णक्रमीय सीमाओं को दूर कर सकती हैं, प्रतिदीप्ति विरंजन को विषाक्त प्रक्रिया 20 माना जाता है, और लंबे समय तक विरंजन या शमन से अवांछित दुष्प्रभाव हो सकते हैं जैसे क्रॉस्लिंकिंग का नुकसान। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट जांच का संग्रह नमूना में बाध्यकारी साइटों के अवरोधन को रोक सकता है, बड़े पैमाने पर मल्टीप्लेक्सिंग और एपोटॉप के मजबूत लक्ष्य को रोक सकता है। इस तरह के कठोर हस्तक्षेप से बचने के लिए, हाल ही में एसट्यूडीआई ने मल्टीप्लेक्सिंग को स्टेचस्टिक एक्सचेंज का उपयोग करके स्वतंत्र रूप से प्रोटीन टुकड़ों को फैलाना 21 जबकि इस पद्धति से सेलुलर संरचनाओं के घने लेबलिंग की अनुमति होती है, पेप्टाइड के टुकड़े को अलग करने के लिए इसे व्यापक जैव रासायनिक तैयारी की आवश्यकता होती है, एकल अणु स्थितियों का पता नहीं लगा सकता है, और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध जांचों का उपयोग करते हुए बड़े पैमाने पर मल्टीप्लेक्सिंग की आसानी से सुविधा नहीं देता है। हम एक विस्तृत विडियो प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो मृदुप्लेकृत, एंटीबॉडी आकार-सीमित डीएसटीओआरएम (मैडमस्टोरएम) इमेजिंग के लिए अनुक्रमिक बंधन और फ्लोरोसेंटली एंटीबॉडी के क्षीणन का वर्णन करते हैं, और सटीक बहाव सुधार और संरेखण प्राप्त करने के लिए फ्लोरोसेंट नैनो हीरे का उपयोग करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
मैडस्टोरम में अनुक्रमिक बहुसंकेतन, बहाव सुधार, और संरेखण प्रक्रिया कोशिकाओं में हीटरोजीनस संरचनाओं के सटीक, अत्यधिक मल्टीप्लेक्स दृश्य की अनुमति देते हैं। 10 इसके अलावा, मैडमस्टोर रंगीन अवर…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम STORM माइक्रोस्कोप तक पहुंच के लिए Xufeng वू धन्यवाद इस शोध को नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट (एनसीआई) के कैंसर अनुसंधान केंद्र और राष्ट्रीय हार्ट फेफड़े और रक्त संस्थान (एनएचएलबीआई) के अंदरूनी अनुसंधान कार्यक्रम द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 8 well coverslip chamber | Lab-tek | 155409 | |
| 0.1% Poly-L-Lysine solution | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| NV-100nm Fluorescent Nano-diamond | Adamas | Red FND | |
| anti-CD3ε antibody | BD Biosciences | 555329 | |
| Bovine serum albumin, Fraction V | KSE Scientific | 98-100P | |
| Triton-X | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 10% Paraformaldehyde | EMS | 15712 | Carcinogen |
| Gelatin from fresh water fish skin | Sigma-Aldrich | G7041 | |
| Alexa 647 antibody labeling kit | Thermo Fisher | A20186 | |
| Magnesium Chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7154 | Highly toxic, air sensitive |
| Cysteamine | Sigma-Aldrich | 30070 | Highly toxic |
| Cyclooctatetraene 98% | Sigma-Aldrich | 138924 | Highly toxic, air sensitive |
| 10x PBS | KD Medical | RGF-3210 | |
| 10x TBS | KD Medical | RGF-3385 |
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