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의학

Trapianto di Schwann Cells PVDF-TrFE condotto a ponte ratto Transected del midollo spinale ceppi per promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il Gap

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Questo articolo descrive una tecnica per inserire un cavo condotto tra i ceppi del midollo spinale dopo il transection completo e riempimento con cellule di Schwann (SCs) e matrice di iniettabili della membrana basale al fine di colmare e promuovere la rigenerazione degli assoni attraverso il gap.

Abstract

Tra i vari modelli per la ferita del midollo spinale nei ratti, il modello di contusione viene utilizzato più spesso perché è il tipo più comune di ferita del midollo spinale umano. Il modello di transection completo, anche se non come clinicamente rilevanti come il modello di contusione, è il metodo più rigoroso per valutare la rigenerazione assonale. Nel modello di contusione, è difficile distinguere rigenerata da assoni germogliati o risparmiati a causa della presenza di rimanere ferita post del tessuto. Nel modello transection completo, un metodo di transizione è necessario colmare la lacuna e creare continuità dalla rostrale ai monconi caudali al fine di valutare l’efficacia dei trattamenti. Una chirurgia ponte affidabile è essenziale per verificare le misure di risultato riducendo la variabilità a causa del metodo chirurgico. I protocolli descritti qui sono utilizzati per preparare Schwann cellule (SCs) e condotti prima del trapianto, transection completo del midollo spinale al livello toracico 8 (T8), inserire il condotto e trapiantare SCs in conduit. Questo approccio viene utilizzato anche in situ gelificante di matrice della membrana dello scantinato iniettabili con trapianto di SC che consente la crescita assonale migliorata attraverso le interfacce rostrale e caudale con il tessuto ospite.

Introduction

Riparazione di lesioni del midollo spinale è un problema complesso e impegnativo che richiederà una strategia di trattamento combinatorio che coinvolgono, ad esempio, l’uso delle cellule e un biomateriale per fornire un microambiente favorevole per la funzione delle cellule trapiantate e axon rigenerazione al luogo della ferita. Emisezione1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transection completo10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelli vengono spesso utilizzati per valutare gli effetti delle terapie a base di biomateriale bridging. Il vantaggio dell’utilizzo di un modello di emisezione è che fornisce maggiore stabilità per il costrutto bridging rispetto al transection completo. Tuttavia, nei modelli emisezione, è difficile dimostrare la rigenerazione dell’assone come risultato del metodo terapeutico applicato a causa della presenza del tessuto ha risparmiato. Il modello di transection completo è il metodo più rigoroso per dimostrare la rigenerazione assonale.

Vari materiali naturali e sintetici sono stati studiati per l’uso come un gel iniettabile, un gel pre-formato inseriti nei modelli emisezione o contusione, o come un condotto strutturato di emisezione o completare il transection modelli (dettagliati nel23 recensioni , 24 , 25). in situ gelificante di una miscela di iniettabili matrice/SC crea un’interfaccia più permissiva tra il trapianto e il cavo di host per l’assone attraversamento26,27 rispetto agli impianti di pre-gellati matrice/SC 5 , 18 , 19 , 28. in situ gelificante ammessi la matrice rifinire i contorni intorno le interfacce host irregolari mentre un condotto più rigido e strutturato o un gel pre-formato meno modellabile non poteva. Un condotto strutturato fornisce spesso Contatta stabilità di guida e dell’impianto in contrasto con una matrice iniettabile. I protocolli presentati qui descrivono una procedura chirurgica che si avvale di una matrice della membrana dello scantinato iniettabili (ad es., matrigel, vedi che la Tabella dei materiali, di cui al come iniettabili matrice qui) e di un condotto strutturato per valutare la rigenerazione assonale nel modello di ferita del midollo spinale più rigoroso.

Elettrofilati poli-vinylidenedifluoride-strato (PVDF-TrFE) allineati fibrosi condotti cavi sono utilizzati nel nostro approccio sperimentale. PVDF-TrFE è un polimero piezoelettrico che genera una carica transitoria quando meccanicamente deforme e ha dimostrato di promuovere la rigenerazione di estensione e assone del neurite sia in vitro29,30 e in vivo 31. elettrofilatura è un comune metodo di fabbricazione di impalcatura che possa rapidamente produrre impalcature fibrose affidabili utilizzando una varietà di polimeri con proprietà controllabile come allineamento della fibra, fibra diametro e spessore dell’impalcatura per neurale e per altre applicazioni32,33,34.

Numerosi studi del ratto SCs trapiantate nei siti di lesione del midollo spinale hanno dimostrato trattamento efficacia5,9,18,19,20,21 ,26. Questi trapianti sono neuroprotective per il tessuto che circonda la lesione, ridurre la dimensione della lesione cavità e promuovere la rigenerazione assonale nel sito di lesione/trapianto e mielinizzazione degli assoni rigenerati. SCs umana può essere autologously trapiantato, un vantaggio rispetto alla maggior parte degli altri correlati neurali cellule24. Dopo una biopsia di nervo periferico, SCs può essere isolato e purificato e prolifereranno fino alla quantità desiderata per il trapianto negli esseri umani. Trapianto autologo di SC per i pazienti danneggiati del midollo spinale ha dimostrato di essere sicuro in Iran35,36,37,38, Cina39,40e la Stati Uniti41,42. SCs sono noti a secernere numerosi fattori neurotrofici e importante per la crescita dell’assone proteine della matrice extracellulare e a svolgere un ruolo essenziale nella rigenerazione assonale dopo lesione del nervo periferico. Nostro obiettivo è quello di descrivere i metodi che possono indagare disegni conduit per migliorare il risultato del trapianto di SC in un modello di transection del midollo spinale del ratto completa.

Protocol

femmina ratti Fischer adulti (peso corporeo di 180-200 g) sono alloggiati secondo linee guida NIH e USDA. L’Animal Care istituzionali ed uso Committee (IACUC) dell’Università di Miami ha approvato tutte le procedure di animali. 1. preparazione pre-trapianto preparazione Conduit. Poi tagliato a 5 mm di lunghezza con una lama #10 sotto un microscopio per dissezione. Nota: Il diametro interno del condotto è tra 2.4-2.7 mm; il diametro esterno è fra…

Representative Results

L’obiettivo dell’utilizzo di questa tecnica chirurgica è quello di valutare l’uso di un tubo strutturato e matrice iniettabili che massimizza la funzione SC dopo trapianto in midolli spinali transected completati. Tre settimane dopo il trapianto, gli animali sono perfusi con paraformaldeide al 4% e le colonne vertebrali sono grossolanamente dissecate e risolto nel fissativo stesso per altre 24 ore. Il midollo spinale viene poi sezionato e i campioni per sezioni sagittali criostato vengon…

Discussion

La fase più critica nella creazione di un modello efficace transection è recidere il midollo spinale in uno o due tagli. Un 2-2.5 mm di distanza tra i ceppi rostrale e caudale del midollo spinale dovrebbe essere presente nel sito di transection. (1) le radici dorsali/ventrali non sono stati rimossi correttamente, (2) il dura ventrale non è stato rimosso adeguatamente, e/o (3) l’animale non è stato posizionato correttamente sul rullo posizionato sotto di lei sono i tre motivi più probabili per un tale divario non app…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il vettore virale e animale core nel progetto di Miami alla cura paralisi per produrre la cura degli animali lenti-GFP-virus e fornendo, rispettivamente e l’istologia e Imaging Core per l’uso del criostato, microscopio confocale, e microscopio a fluorescenza con Stereo Investigator. Finanziamento è stato fornito da NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge è il Christine E Lynn distinto professore di neuroscienze.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
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References

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Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
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