JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
의학

Transplantation af Schwann celler inde PVDF-TrFE ledningsnet til bro Transected rotte rygmarven træstubbe for at fremme Axon regenerering over kløften

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

I denne artikel beskrives en teknik til at indsætte en hule conduit mellem rygmarven stubbe efter komplet transection og fyld med Schwann celler (SCs) og injicerbar basalmembranen matrix for at bygge bro og fremme axon regeneration på tværs af hullet.

Abstract

Blandt forskellige modeller for rygmarvsskader i rotter bruges kontusion model mest ofte fordi det er den mest almindelige type af menneskelige rygmarvsskader. Komplet transection model, er men ikke som klinisk relevant som kontusion model, den mest stringent metode til at evaluere axon regenerering. I kontusion model er det vanskeligt at skelne regenereret fra spirede eller skånet axoner på grund af tilstedeværelsen af de resterende post vævsskade. I komplet transection model er en “passerelle” metode nødvendigt at udfylde tomrummet og skabe kontinuitet fra den rostralt til caudale stubbe for at evaluere effektiviteten af behandlingerne. En pålidelig passerelle kirurgi er afgørende for at teste resultatet foranstaltninger ved at reducere variabiliteten på grund af den kirurgiske metode. De protokoller er beskrevet her er brugt til at forberede Schwann celler (SCs) og ledningsanlæg før transplantation, komplet transection af rygmarven på thorax plan 8 (T8), indsætte kanalen, og transplantation SCs ind på conduit. Denne fremgangsmåde bruger også i situ geldannende af en injicerbar basalmembranen matrix med SC transplantation, der giver forbedret axon vækst på tværs af de rostralt og caudale grænseflader med værten væv.

Introduction

Rygmarv skade reparation er en kompleks og udfordrende problem, som vil kræve en kombinatorisk behandlingsstrategi, der omfatter, for eksempel, brug af celler og en biomateriale at skabe en gunstig mikromiljø for transplanterede cellefunktion og axon Regeneration på stedet for skade. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 og komplet transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller er ofte bruges til at vurdere virkningerne af biomateriale-baserede passerelle behandlinger. Fordelen ved at bruge en hemisection model er, at det giver mere stabilitet for passerelle konstruktionen i forhold til komplet transection. I hemisection modeller, er det imidlertid vanskeligt at bevise axon regenerering som et resultat af den anvendte terapeutiske metode på grund af tilstedeværelsen af skånet væv. Komplet transection model er den mest stringent metode til at påvise axon regenerering.

Forskellige naturlige og syntetiske materialer er blevet undersøgt til brug som en injicerbar gel, en præ-dannet gel placeret i kontusion eller hemisection modeller, eller som en struktureret conduit i hemisection eller komplet transection modeller (detaljeret i anmeldelser23 , 24 , 25). in situ geldannende af en injicerbar matrix/SC blanding skaber en mere eftergivende grænseflade mellem transplantation og vært ledningen til axon passage26,27 i forhold til pre geléagtig matrix/SC implantater 5 , 18 , 19 , 28. i situ geldannende tilladt matrix til kontur omkring uregelmæssige vært grænseflader der henviser til, at en mere stiv og struktureret conduit eller en mindre moldable præformerede gel ikke kunne. En struktureret conduit giver ofte kontakt vejledning og implantat stabilitet i modsætning til en injicerbar matrix. Protokollerne præsenteres her beskrive en kirurgisk procedure, der udnytter både en injicerbar basalmembranen matrix (f.eks. matrigel, se Tabel af materialer, omhandlet som injicerbar matrix her) og en struktureret kanal til evaluere axon regenerering i den strengeste rygmarv skade model.

Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluorethylen (PVDF-TrFE) justeret fibrøst hule ledningsanlæg bruges i vores eksperimenterende tilgang. PVDF-TrFE er en piezoelektriske polymer, der genererer en forbigående afgift når mekanisk deforme og har vist sig at fremme neurite forlængelse og axon regenerering både in vitro-29,30 og in vivo 31. Electrospinning er en fælles stillads fabrikationsanlæg metode, der hurtigt kan producere pålidelige fibrøst stilladser ved hjælp af en række polymerer med kontrollerbare egenskaber som fiber justering, fiber diameteren og tykkelsen af stillads til neurale og andre applikationer32,33,34.

Talrige undersøgelser af rotte SCs transplanteret ind i rygmarv skade websteder har demonstreret behandling virkning5,9,18,19,20,21 ,26. Disse Transplantationer er neuroprotektive for væv omkring læsion, reducere læsion hulrum størrelse og fremme axon regenerering i læsion/transplantation site og myelination af regenereret axoner. Menneskelige SCs kan transplanteres autologously, en fordel i forhold til de fleste andre neurale-relaterede celler24. Efter en perifer nerve biopsi, SCs kan isoleres og renses og vil formere sig til den ønskede mængde til transplantation ind i mennesker. Autolog SC transplantation for rygmarvsskadede patienter har vist sig for at være sikkert i Iran35,36,37,38, Kina39,40, og den USA41,42. SCs er kendt for at udskille talrige neurotrope faktorer og ekstracellulære matrix proteiner vigtigt for axon vækst og til at spille en væsentlig rolle i axon regenerering efter perifer nerveskade. Vores mål her er at beskrive metoder, der kan undersøge conduit design til at forbedre resultatet af SC transplantation i en komplet rotte rygmarven transection model.

Protocol

kvindelige voksne Fischer rotter (180-200 g kropsvægt) er anbragt ifølge NIH og USDA retningslinjer. Den institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) på University of Miami godkendt alle animalske procedurer. 1. før Transplantation forberedelse Conduit forberedelse. Afskåret 5 mm i længden ved hjælp af en #10 blade under et mikroskop for dissekere conduit. Bemærk: Den indvendige diameter af kanalen er mellem 2,4-2.7 mm; den ydre diame…

Representative Results

Målet med ved hjælp af denne kirurgiske teknik er at evaluere brugen af en struktureret conduit og injicerbar matrix, der maksimerer SC funktion efter transplantation til færdige transected rygmarv. Tre uger efter transplantation, dyrene er perfunderet med 4% PARAFORMALDEHYD og rygsøjler er groft dissekeret og fast i den samme fixativ for en anden 24 h. Rygmarven er derefter dissekeret og prøver for sagittal frysemikrotomsnit er placeret i en 30% rørsukkeropløsning for cryoprotecti…

Discussion

Det mest afgørende skridt i at skabe en effektiv transection model er severing rygmarven i én eller to nedskæringer. Et 2-2,5 mm hul mellem rostralt og caudale rygmarven stubbe bør være til stede på webstedet transection. De tre mest sandsynligt årsager til sådan et hul ikke vises er (1) de dorsale/ventral rødder ikke blev fjernet korrekt, (2) den ventrale dura blev ikke fjernet tilstrækkeligt og/eller (3) dyr blev ikke placeret korrekt på rullen placeret under hende.

Til at udføre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Viral vektor og dyr kerner på Miami projektet til Cure lammelse for at producere den lenti-normal god landbrugspraksis-virus og giver dyrs pleje, henholdsvis, og histologi og Imaging kerner for brug af kryostaterne, Konfokal mikroskop, og fluorescerende mikroskop med Stereo Investigator. Finansieringen blev leveret af NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) og NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge er det Christine E Lynn Distinguished Professor i neurovidenskab.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. King, V. R., Alovskaya, A., Wei, D. Y., Brown, R. A., Priestley, J. V. The use of injectable forms of fibrin and fibronectin to support axonal ingrowth after spinal cord injury. Biomaterials. 31 (15), 4447-4456 (2010).
  2. Liu, T., Houle, J. D., Xu, J., Chan, B. P., Chew, S. Y. Nanofibrous collagen nerve conduits for spinal cord repair. Tissue Eng Part A. 18 (9-10), 1057-1066 (2012).
  3. Novikova, L. N., Pettersson, J., Brohlin, M., Wiberg, M., Novikov, L. N. Biodegradable poly-beta-hydroxybutyrate scaffold seeded with Schwann cells to promote spinal cord repair. Biomaterials. 29 (9), 1198-1206 (2008).
  4. Bamber, N. I., Li, H., Aebischer, P., Xu, X. M. Fetal spinal cord tissue in mini-guidance channels promotes longitudinal axonal growth after grafting into hemisected adult rat spinal cords. Neural Plast. 6 (4), 103-121 (1999).
  5. Xu, X. M., Zhang, S. X., Li, H., Aebischer, P., Bunge, M. B. Regrowth of axons into the distal spinal cord through a Schwann-cell-seeded mini-channel implanted into hemisected adult rat spinal cord. Eur J Neurosci. 11 (5), 1723-1740 (1999).
  6. Bamber, N. I., et al. Neurotrophins BDNF and NT-3 promote axonal re-entry into the distal host spinal cord through Schwann cell-seeded mini-channels. European Journal of Neuroscience. 13 (2), 257-268 (2001).
  7. Iannotti, C., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor-enriched bridging transplants promote propriospinal axonal regeneration and enhance myelination after spinal cord injury. Exp Neurol. 183 (2), 379-393 (2003).
  8. Deng, L. X., et al. GDNF modifies reactive astrogliosis allowing robust axonal regeneration through Schwann cell-seeded guidance channels after spinal cord injury. Exp Neurol. 229 (2), 238-250 (2011).
  9. Deng, L. X., et al. A Novel Growth-Promoting Pathway Formed by GDNF-Overexpressing Schwann Cells Promotes Propriospinal Axonal Regeneration, Synapse Formation, and Partial Recovery of Function after Spinal Cord Injury. J Neurosci. 33 (13), 5655-5667 (2013).
  10. Chen, X., et al. Bone marrow stromal cells-loaded chitosan conduits promote repair of complete transection injury in rat spinal cord. J Mater Sci Mater Med. 22 (10), 2347-2356 (2011).
  11. Hurtado, A., et al. Robust CNS regeneration after complete spinal cord transection using aligned poly-L-lactic acid microfibers. Biomaterials. 32 (26), 6068-6079 (2011).
  12. Cheng, H., Huang, Y. C., Chang, P. T., Huang, Y. Y. Laminin-incorporated nerve conduits made by plasma treatment for repairing spinal cord injury. Biochem Biophys Res Commun. 357 (4), 938-944 (2007).
  13. Fan, J., et al. Neural regrowth induced by PLGA nerve conduits and neurotrophin-3 in rats with complete spinal cord transection. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 97 (2), 271-277 (2011).
  14. Lietz, M., et al. Physical and biological performance of a novel block copolymer nerve guide. Biotechnol Bioeng. 93 (1), 99-109 (2006).
  15. Novikova, L. N., Novikov, L. N., Kellerth, J. O. Biopolymers and biodegradable smart implants for tissue regeneration after spinal cord injury. Curr Opin Neurol. 16 (6), 711-715 (2003).
  16. Tang, S., et al. The effects of controlled release of neurotrophin-3 from PCLA Scaffolds on the survival and neuronal differentiation of transplanted neural stem cells in a rat spinal cord injury model. PLoS One. 9 (9), e107517 (2014).
  17. Yao, L., et al. Improved axonal regeneration of transected spinal cord mediated by multichannel collagen conduits functionalized with neurotrophin-3 gene. Gene Ther. , (2013).
  18. Xu, X. M., Guénard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Axonal regeneration into Schwann cell-seeded guidance channels grafted into transected adult rat spinal cord. J Comp Neurol. 351 (1), 145-160 (1995).
  19. Xu, X. M., Chen, A., Guenard, V., Kleitman, N., Bunge, M. B. Bridging Schwann cell transplants promote axonal regeneration from both the rostral and caudal stumps of transected adult rat spinal cord. J Neurocytol. 26 (1), 1-16 (1997).
  20. Takami, T., et al. Schwann cell but not olfactory ensheathing glia transplants improve hindlimb locomotor performance in the moderately contused adult rat thoracic spinal cord. J Neurosci. 22 (15), 6670-6681 (2002).
  21. Bunge, M. B., Wood, P. M. . Handbook of Clinical Neurology. 109, 523-540 (2012).
  22. Fortun, J., Hill, C. E., Bunge, M. B. Combinatorial strategies with Schwann cell transplantation to improve repair of the injured spinal cord. Neurosci Lett. 456 (3), 124-132 (2009).
  23. Haggerty, A. E., Oudega, M. Biomaterials for spinal cord repair. Neurosci Bull. , (2013).
  24. Nomura, H., Tator, C. H., Shoichet, M. S. Bioengineered strategies for spinal cord repair. J Neurotrauma. 23 (3-4), 496-507 (2006).
  25. Straley, K. S., Foo, C. W. P., Heilshorn, S. C. Biomaterial Design Strategies for the Treatment of Spinal Cord Injuries. J Neurotrauma. 27 (1), 1-19 (2010).
  26. Williams, R. R., Henao, M., Pearse, D. D., Bunge, M. B. Permissive Schwann cell graft/spinal cord interfaces for axon regeneration. Cell Transplant. 24 (1), 115-131 (2015).
  27. Williams, R. R., Pearse, D. D., Tresco, P. A., Bunge, M. B. The assessment of adeno-associated vectors as potential intrinsic treatments for brainstem axon regeneration. J Gene Med. 14 (1), 20-34 (2012).
  28. Xu, X. M., Guenard, V., Kleitman, N., Aebischer, P., Bunge, M. B. A combination of BDNF and NT-3 promotes supraspinal axonal regeneration into Schwann cell grafts in adult rat thoracic spinal cord. Exp Neurol. 134 (2), 261-272 (1995).
  29. Lee, Y. S., Arinzeh, T. L. The influence of piezoelectric scaffolds on neural differentiation of human neural stem/progenitor cells. Tissue Eng Part A. 18 (19-20), 2063-2072 (2012).
  30. Lee, Y. S., Collins, G., Arinzeh, T. L. Neurite extension of primary neurons on electrospun piezoelectric scaffolds. Acta Biomater. 7 (11), 3877-3886 (2011).
  31. Lee, Y. S., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Enhanced noradrenergic axon regeneration into schwann cell-filled PVDF-TrFE conduits after complete spinal cord transection. Biotechnol Bioeng. 114 (2), 444-456 (2017).
  32. Haider, A., Haider, S., Kang, I. -. K. A comprehensive review summarizing the effect of electrospinning parameters and potential applications of nanofibers in biomedical and biotechnology. Arab J Chem. , (2015).
  33. Hassiba, A. J., et al. Review of recent research on biomedical applications of electrospun polymer nanofibers for improved wound healing. Nanomedicine (Lond). 11 (6), 715-737 (2016).
  34. Lee, Y. -. S., Livingston Arinzeh, T. Electrospun Nanofibrous Materials for Neural Tissue Engineering. Polymers. 3 (1), 413-426 (2011).
  35. Oraee-Yazdani, S., et al. Co-transplantation of autologous bone marrow mesenchymal stem cells and Schwann cells through cerebral spinal fluid for the treatment of patients with chronic spinal cord injury: safety and possible outcome. Spinal Cord. 54 (2), 102-109 (2016).
  36. Saberi, H., et al. Safety of intramedullary Schwann cell transplantation for postrehabilitation spinal cord injuries: 2-year follow-up of 33 cases. J Neurosurg Spine. 15 (5), 515-525 (2011).
  37. Saberi, H., et al. Treatment of chronic thoracic spinal cord injury patients with autologous Schwann cell transplantation: an interim report on safety considerations and possible outcomes. Neurosci Lett. 443 (1), 46-50 (2008).
  38. Yazdani, S. O., et al. A comparison between neurally induced bone marrow derived mesenchymal stem cells and olfactory ensheathing glial cells to repair spinal cord injuries in rat. Tissue Cell. 44 (4), 205-213 (2012).
  39. Zhou, X. H., et al. Transplantation of autologous activated Schwann cells in the treatment of spinal cord injury: six cases, more than five years of follow-up. Cell Transplant. 21, S39-S47 (2012).
  40. Chen, L., et al. A prospective randomized double-blind clinical trial using a combination of olfactory ensheathing cells and Schwann cells for the treatment of chronic complete spinal cord injuries. Cell Transplant. 23, S35-S44 (2014).
  41. Guest, J., Santamaria, A. J., Benavides, F. D. Clinical translation of autologous Schwann cell transplantation for the treatment of spinal cord injury. Curr Opin Organ Transplant. 18 (6), 682-689 (2013).
  42. Bunge, M. B., Monje, P. V., Khan, A., Wood, P. M. . Progress in Brain Research. , (2017).
  43. Meijs, M. F., et al. Basic fibroblast growth factor promotes neuronal survival but not behavioral recovery in the transected and Schwann cell implanted rat thoracic spinal cord. J Neurotrauma. 21 (10), 1415-1430 (2004).
  44. Blits, B., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of neural progenitor cells before implantation into injured spinal cord and brain to detect their migration, deliver neurotrophic factors and repair tissue. Restor Neurol Neurosci. 23 (5-6), 313-324 (2005).
  45. Follenzi, A., Naldini, L. HIV-based vectors. Preparation and use. Methods Mol Med. 69, 259-274 (2002).
  46. Fouad, K., et al. Combining Schwann cell bridges and olfactory-ensheathing glia grafts with chondroitinase promotes locomotor recovery after complete transection of the spinal cord. J Neurosci. 25 (2), 1169-1178 (2005).
  47. Bates, M. L., Puzis, R., Bunge, M. B., Lane, E. L., Dunnett, S. B. . Animal Models of Movement Disorders: Volume II. , 381-399 (2011).

Tags

Schwann CellsPVDF-TrFE ConduitsSpinal Cord TransectionAxon RegenerationLaminectomyRat ModelSurgical Procedure

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image