מאמר זה מתאר שיטה להוספת צינור חלול בין גדמי חוט השדרה לאחר חיתוך מלא מילוי עם תאי שוואן (SCs), קרום המרתף להזרקה מטריקס על מנת לגשר, לקדם התחדשות האקסון על פני הפער.
בין מודלים שונים עבור פגיעה בחוט השדרה אצל חולדות, המודל החבורה משמש לעתים קרובות ביותר כי הוא הסוג הנפוץ ביותר של פגיעה בחוט השדרה האנושית. המודל המלא חיתוך, אמנם לא כמו קלינית הרלוונטיים כמודל החבורה, היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להעריך את האקסון התחדשות. במודל החבורה, קשה להבחין מחדש של אקסונים נבט או והבחירה הנכונה מצילה בשל נוכחותם של הנותרים רקמות שלאחר הפציעה. במודל חיתוך מלאה, שיטת הגישור יש צורך למלא את הפער וליצור המשכיות של rostral גדמי סימטרית על מנת להעריך את האפקטיביות של הטיפולים. ניתוח גישור אמין חיוני כדי לבדוק את התוצאה אמצעים על-ידי הפחתת מידת ההשתנות בשל שיטת. הפרוטוקולים המתוארים כאן משמשים להכנת שוואן תאים (SCs), תעלות לפני ההשתלה, חיתוך מלאה של חוט השדרה החזי רמה 8 (T8), הכנס את הצינור ולאחר השתלת SCs לתוך הצינור. גישה זו משתמשת גם בחיי עיר ג’לי של מטריקס קרום המרתף בזריקות עם השתלת SC המאפשר צמיחה האקסון משופרת על פני הממשקים rostral וסימטרית עם רקמת המארח.
תיקון פגיעה בחוט השדרה הוא בעיה מורכבים ומאתגרים שיחייבו טיפול קומבינטורית אסטרטגיה מעורבים, לדוגמה, השימוש של תאים biomaterial לפרנס microenvironment חיובית ותפקוד התאים המושתלים האקסון התחדשות באתר של פציעה. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 , חיתוך מלא10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 מודלים משמשים לעתים קרובות כדי להעריך את ההשפעות של biomaterial מבוססי טיפולים גישור. היתרון של שימוש דגם hemisection הוא כי הוא מספק יציבות יותר הבונה גישור לעומת חיתוך מלאה. עם זאת, hemisection דגמים, קשה להוכיח התחדשות האקסון כפועל של השיטה הטיפולית יישומית בשל נוכחותם של רקמות והבחירה הנכונה מצילה. המודל חיתוך מלאה היא השיטה ואינטלקטואלית כדי להדגים האקסון התחדשות.
חומרים טבעיים וסינתטיים שונים נחקרו לשימוש ג’ל להזרקה, ג’ל הקבועים מראש להציב החבורה או מודלים hemisection, או כצינור תקשורת מובנית לתוך hemisection או להשלים חיתוך מודלים (מפורט את הדעת23 , 24 , 25). בחיי עיר ג’לי של תערובת להזרקה מטריקס/SC יוצר ממשק יותר מתירני בין ההשתלה את כבל מארח האקסון המעבר26,27 לעומת מטריקס וג’ל מראש/SC שתלים 5 , 18 , 19 , 28. בחיי עיר ג’לי מותר המטריקס כדי ליצור מתאר סביב הממשקים המארח לא סדיר בעוד צינור קשיח ומובנים יותר או פחות moldable ג’ל הקבועים מראש לא יכול. צינור מובנים לעיתים קרובות מספק הדרכה קשר ויציבות השתל לעומת מטריקס להזרקה. הפרוטוקולים המובאת כאן לתאר את הליך כירורגי מנצל של מטריקס להזרקה קרום המרתף (למשל, matrigel, ראה הטבלה של חומרים, המכונה כמו מטריקס להזרקה כאן) והן צינור מובנים הערכת האקסון התחדשות במודל פגיעה בחוט השדרה ואינטלקטואלית.
Electrospun פולי-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) מיושר תעלות חלול סיביים משמשים בגישתנו ניסיוני. PVDF-TrFE הוא פולימר פיזואלקטריים יוצר מטען ארעי כאשר מכנית מעוות ולא הוכח לקדם התחדשות האקסון והסיומת neurite הן במבחנה29,30 , ויוו בתוך 31. Electrospinning היא שיטה נפוצה לגרדום פבריקציה נוספת שיכול לייצר במהירות אמין פיגומים סיביים באמצעות מגוון של פולימרים עם מאפיינים לשליטה כגון יישור סיבים, סיבים בקוטר עובי לגרדום עבור 33,32,עצבית ויישומים אחרים34.
מחקרים רבים של עכברוש SCs מושתלים לתוך חוט השדרה פגיעה באתרים הראו הטיפול היעילות5,9,18,19,20,21 ,26. השתלות אלה הן neuroprotective בשביל לרקמות שמסביב לפצע, לצמצם את גודל חלל הנגע, לקדם התחדשות האקסון לתוך הנגע/השתלת האתר ואת myelination של האקסונים מחדש. יכול להיות מושתלים autologously SCs אנושי, יתרון לעומת שאר עצביות הקשורות תאים24. לאחר ביופסיה במערכת העצבים ההיקפית, SCs יכול להיות מבודדת וטיהרו ו ותתנהל כדי הסכום הרצוי עבור השתלת לתוך בני אדם. עצמיים השתלת SC לחולים חוט השדרה נפגע הוכח כדי להיות בטוחים איראן35,36,37,38,39,סין40, ו ארצות הברית41,42. SCs ידועים להפריש מספר גורמים neurotrophic של מטריצה חוץ-תאית חלבונים חשובים לצמיחה האקסון וכדי לשחק תפקיד חיוני האקסון התחדשות לאחר פגיעה במערכת העצבים ההיקפית. מטרתנו כאן היא לתאר את שיטות אשר יכולים לחקור conduit עיצובים כדי לשפר את התוצאה של השתלת SC במודל חיתוך בחוט השדרה עכברוש שלם.
השלב הקריטי ביותר ביצירת מודל חיתוך יעיל קטיעת חוט השדרה ב חתכים אחד או שניים. פער 2-2.5 מ מ בין ליער rostral, סימטרית השדרה צריך להיות נוכח באתר חיתוך. הסיבות ככל הנראה שלושה פער לא מופיע הן שורשים הגחוני הגבי / / (1) שלא הוסרו כראוי, (2) דורא הגחון לא הוסר כראוי, ו/או היה (3) בעל החיים אינו ממוקם כראוי ע?…
The authors have nothing to disclose.
ברצוננו להודות את וקטור ויראלי ואת חיה ליבות בפרויקט מיאמי תרופה לשיתוק בהפקת הטיפול בבעלי חיים lenti-GFP-וירוס ומספקת, בהתאמה, היסטולוגיה ואת ליבות הדמיה לשימוש של cryostat, מיקרוסקופ קונפוקלי, והוא מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם החוקר סטריאו. מימון סופק על ידי NINDS (09923), משרד ההגנה (W81XWH-14-1-0482) ואת ה-NSF (DMR-1006510). מ ב בונחה הוא כריסטין E לין נכבדים פרופסור של מדעי המוח.
Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
#10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
Confocal Microscopy | Nikon | clsi |