Denne artikkelen beskriver en teknikk for å sette inn en hul kanal mellom ryggmargen stubber etter fullført transection og fyll med Schwann cellene (SCs) og injiserbare kjelleren membran matrise for å bygge og markedsføre axon gjenfødelse på gapet.
Blant ulike modeller for ryggmargsskade i rotter brukes oftest contusion modellen fordi det er den vanligste typen menneskelige ryggmargsskade. Komplett transection modellen, er men ikke som klinisk relevante som contusion modell, den strengeste metoden å evaluere axon gjenfødelse. I contusion modellen er det vanskelig å skille gjenskapte fra spiret eller spart axons av gjenværende vev innlegg skade. Komplett transection modellen er bygge bro metode nødvendig å fylle gapet og opprette kontinuitet fra den rostral til de caudal stumper for å vurdere effektiviteten av behandlingene. En pålitelig bygge bro kirurgi er viktig å teste utfallsmål ved å redusere variasjon på grunn av kirurgiske metoden. Protokollene beskrives her brukes til å forberede Schwann celler (SCs) og kanaler før transplantasjon, fullstendig transection i ryggmargen i thorax level 8 (T8), sette kanal og transplantere SCs i kanal. Denne fremgangsmåten bruker også i situ gelling av en injiserbare kjelleren membran matrise med SC transplantasjon som gir forbedret axon vekst over de rostral og caudal grensesnittene med vert vev.
Ryggmarg skade reparasjon er et komplisert og utfordrende problem som krever en kombinasjon behandling strategi som involverer, for eksempel, bruk av celler og en biomateriale å gi en gunstig microenvironment for transplantert celle funksjon og axon regenerering på stedet for skade. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 og komplett transection10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modeller brukes ofte til å vurdere effekten av biomateriale-basert bygge bro behandling. Fordelen med å bruke en hemisection modell er at det gir mer stabilitet for bygge bro Konstruer sammenlignet med komplett transection. I hemisection modeller er det imidlertid vanskelig å bevise axon fornyelse som et resultat av anvendt terapeutiske metoden på grunn av tilstedeværelsen av spart vev. Komplett transection modellen er den strengeste metoden å demonstrere axon gjenfødelse.
Ulike naturlige og syntetiske materialer har blitt studert som en injeksjon gel, en pre-formet gel plassert i contusion eller hemisection modeller, eller som en strukturert kanal i hemisection eller fullføre transection modeller (detaljert i anmeldelser23 , 24 , 25). in situ gelling en injiserbare matrise/SC blanding oppretter et mer ettergivende grensesnitt mellom transplantasjon og vert ledningen for axon krysset26,27 sammenlignet pre gelled matrise/SC implantater 5 , 18 , 19 , 28. i situ gelling tillatt matrix å kontur rundt de uregelmessig vertsgrensesnitt mens en mer rigid og strukturert kanal eller en mindre formes pre-formet gel ikke kan. En strukturert kanal gir ofte kontakt veiledning og implantat stabilitet i motsetning til en injiserbare matrise. Protokollene presenteres her beskriver et kirurgisk inngrep som utnytter en injiserbare kjelleren membran matrise (f.eks matrigel, se Tabell av materialer, referert til som injiserbare matrix her) og en strukturert kanal til evaluere axon fornyelse i de strengeste ryggmarg skade modellen.
Electrospun poly-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) justert fibrøs hult rør brukes i vår eksperimentelle tilnærming. PVDF-TrFE er en piezoelectric polymer som genererer en forbigående kostnad når mekanisk deformert og har vist seg å fremme neurite forlengelse og axon regenerering både i vitro29,30 og i vivo 31. Electrospinning er en vanlig stillaset fabrikasjon metode som kan raskt produsere pålitelige fibrøs stillaser bruker en rekke polymerer med kontrollerbar egenskaper som fiber justering, fiber diameter og tykkelsen på skafottet for nevrale og andre programmer32,33,34.
Tallrike studier av rotte SCs transplantert inn i ryggmargen skaden nettsteder har vist behandling effekt5,9,18,19,20,21 ,26. Disse transplantasjoner er neuroprotective for vevet rundt lesjonen, redusere lesjon hulrom størrelse og fremme axon regenerering i lesjon/transplantasjon området og myelination av gjenfødte axons. En fordel i forhold til de fleste andre neural-relaterte celler24menneskelige SCs kan transplanteres autologously. Etter en ekstern nerve biopsi, SCs kan være isolert og renset og vil spre seg til det ønskede beløpet for transplantasjon i mennesker. Autolog SC transplantasjon for ryggmargen skadet pasienter har vist seg for å være trygg i Iran35,36,37,38, Kina39,40, og USA41,42. SCs er kjent for å skille ut mange nevrotropisk faktorer og ekstracellulær matrix proteiner viktig for axon vekst og spille en viktig rolle i axon regenerering etter eksterne nerve skader. Vårt mål er å beskrive metoder som kan undersøke kanal design å forbedre resultatet av SC transplantasjon i en komplett rotte ryggmargen transection modell.
Det viktigste trinnet i å skape en effektiv transection modell er kuttet ryggmargen i en eller to kutt. En 2-2.5 mm avstand mellom rostral og caudal ryggmargen stubber bør være til stede på transection nettstedet. Tre mest sannsynlige årsakene til slikt tomrom vises ikke er (1) dorsal/ventrale røtter ikke ble riktig fjernet, (2) ventrale dura ble ikke fjernet tilstrekkelig eller (3) dyret var ikke plassert riktig på roll plassert under henne.
Utføre en effektiv kanal innsetting mellom …
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne takke Viral vektor og dyr kjerner på Miami prosjektet kur lammelse for produsere lenti-GFP-virus og gi dyr omsorg, henholdsvis og Histology og Imaging kjerner for bruk av kryostaten, AC confocal mikroskop, og fluorescerende mikroskop med Stereo etterforsker. Midler ble gitt av NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) og NSF (DMR-1006510). MB Bunge er Christine E Lynn Distinguished Professor av nevrovitenskap.
Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
#10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
Confocal Microscopy | Nikon | clsi |