Эта статья описывает метод для вставки полые связующим звеном между спинного пни после полного перерезка и заполнить Шванновские клетки (СКС) и инъекционные базальной мембраны матрицы для моста и способствуют регенерации аксона через пробел.
Среди различных моделей для спинного мозга крыс наиболее часто используется модель ушиба, потому что это наиболее распространенный тип спинного мозга человека. Полный перерезка модель, хотя не как клинически значимых как модель ушиба, является наиболее строгий метод оценки регенерации аксона. В модели ушиба трудно отличить регенерированного из проросших или пощадил аксоны благодаря наличию остающихся пост повреждения тканей. В модели полного перерезка метод перемычки необходимо заполнить этот пробел и создать преемственность с ростральной хвостового пни для того чтобы оценить эффективность лечения. Надежный мост хирургия имеет важное значение для проверки исходов снижая изменчивость из-за хирургический метод. Протоколы, описанные здесь используются для подготовки Шванновские клетки (СКС) и трубопроводы до трансплантации, полный перерезка спинного мозга на грудном уровне 8 (T8), вставить каналом и пересадить СКС в канал. Этот подход также использует в situ гелеобразующего инъекционные базальной мембраны матрицы с SC трансплантации, который позволяет улучшенная аксона роста через интерфейсы ростральной и хвостового с ткани макроорганизма.
Ремонт повреждений спинного мозга является сложной и трудной проблемой, которая потребует стратегии комбинаторного лечения с участием, например, использование клеток и биоматериал обеспечить благоприятное микроокружение для функции пересаженных клеток и аксон Регенерация на месте травмы. Гемисекция1,2,3,4,5,6,,78,9 и полный перерезка10 ,11,12,13,14,,1516,,1718,19 ,20,,2122 модели часто используются для оценки последствий на основе биоматериала преодоление терапии. Преимущество использования гемисекция модель является, что он обеспечивает большую стабильность для моста конструкции, по сравнению с полной перерезка. Однако в моделях гемисекция, трудно доказать регенерации аксона как результат прикладной терапевтического метода связано с наличием пощадил ткани. Полный перерезка модель является наиболее строгий метод продемонстрировать регенерации аксона.
Были изучены различные природные и синтетические материалы для использования в качестве инъекционный гель, предварительно сформированных гель помещается в ушиб или гемисекция модели, или как структурированной каналом в гемисекция или завершить перерезка модели (подробные отзывы23 , 24 , 25). в situ гелеобразующего смеси инъекционные матрица/SC создает более либеральными интерфейс между трансплантации и принимающей шнур для axon пересечения26,27 по сравнению с предварительно загущенное матрица/SC имплантатов 5 , 18 , 19 , 28. в situ гелеобразующего допускается матрицы контур вокруг нерегулярных хост интерфейсов, в то время как более жесткой и структурированных каналом или менее moldable предварительно сформированных гель не может. Структурированный каналом часто обеспечивает контакт руководство и имплантат стабильность в отличие от инъекционного матрицы. Протоколы, здесь представлены описания хирургическая процедура, которая использует матрицу инъекционные базальной мембраны (например, matrigel, см. Таблицу материалы, упоминаемые как инъекционные матрицы здесь) и структурированных каналом для Оцените регенерации аксона в самые строгие модели травмы спинного мозга.
Electrospun поли vinylidenedifluoride трифторэтиленом (PVDF-ТрФЭ) соответствие волокнистых полые трубы используются в нашем экспериментальном подходе. PVDF-ТрФЭ является пьезоэлектрический полимер, который генерирует переходных заряда, когда механически деформируется и показал neurite расширение и аксон регенерации в vitro29,30 и в естественных условиях 31. Electrospinning является распространенным методом изготовления лески, который может быстро производить надежные волокнистых подмостей, с использованием различных полимеров с управляемыми свойствами, такими как выравнивание волокна, волокна диаметр и толщину лески для Нейронные и других приложений32,,3334.
Многочисленные исследования крыс SCs, пересаженные в сайты травмы спинного продемонстрировали лечения эффективность5,9,18,19,20,21 ,26. Эти трансплантаты являются нейропротекторной для ткани вокруг очага поражения, уменьшить размер полости поражения и способствуют регенерации аксона в сайт поражения/трансплантации и миелинизации регенерированный аксонов. Можно autologously трансплантированы человеческой SCs, преимущество по сравнению с большинством других связанных с нервной клетки24. После биопсии периферических нервов, СКС может быть изолированный и очищенный и будет распространяться на нужную сумму для трансплантации в людей. Аутологичной трансплантации SC для позвоночника пациентов было доказано быть безопасными в Иране35,,3637,38, Китай39,40и 42Соединенные Штаты41,. СКС, как известно, выделяют многочисленные нейротрофических факторов и белков внеклеточного матрикса, важное значение для роста аксона и играть важную роль в регенерации аксона после травмы периферических нервов. Наша цель здесь — для описания методов, которые можно исследовать трубы конструкции улучшить результаты трансплантации SC в полной крыса спинного перерезка модели.
Наиболее важным этапом в создании эффективной перерезка модели разрыва спинного мозга в одной или двух разрезов. 2-2,5 мм зазор между ростральной и хвостовой спинного пни должны присутствовать на сайте перерезка. Три наиболее вероятные причины такой разрыв не появляется являются (1) спин…
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить вирусный вектор и животных ядер в Майами проекта для лечения паралича для производства lenti-GFP-вирус и обеспечение ухода за животными, соответственно, гистология и изображений ядра для использования криостат, конфокального микроскопа, и Флуоресцентный микроскоп с стерео следователь. Финансирование было предоставлено NSF (DMR-1006510), NINDS (09923) и МО (W81XWH-14-1-0482). М.б. Бунге является Кристина E Линн Уважаемый профессор неврологии.
Cryogenic vials | ThermoFisher Scientific | 5000-0020 | |
10 cm Petri dish | VWR | 25382-428 | |
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 | ThermoFisher Scientific | 11039-021 | "DMEM/F12" in protocol. |
Penicillin-streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | "Pen/Strep" in protcol. |
Fetal bovine serum | Hyclone | SH300-70-03 | "FBS" in protocol. |
Pituitary extract | Biomedical Technologies | BT-215 | |
Forskolin | Sigma-Aldrich | F6886 | |
Heregulin | R&D Systems | 396-HB/CF | |
Poly L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | "PLL" in protocol. |
Dulbecco's modified Eagle's medium | ThermoFisher Scientific | 11965-092 | "DMEM" in protocol. |
Hank's balanced salt solution | ThermoFisher Scientific | 14170-112 | "HBSS" in protocol. |
Tryspin-EDTA | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | |
Female Fischer rat (160-180g) | Envigo | ||
Vannas scissor, straight | FST | 15018-10 | |
Ketamine | Vedco Inc | 5098976106 | 100 mg/ml |
Xylazine | Lloyd Inc | AnaSed | 20 mg/ml |
Gentamycin | APP Pharmaceuticals | NDC 63323-010-02 | Can be any brand of choice. |
Micro Spatula | FST | 10089-11 | Can be any brand of choice. |
Curved scissors with blunt end | FST | 14017-18 | Can be any brand of choice. |
Blunt forceps | FST | 11006-12 | Can be any brand of choice. |
rongeur | FST | 16121-14 | Can be any brand of choice. |
Angled spring scissors | FST | 15006-09 | Can be any brand of choice. |
Absorption triangles | FST | 18105-03 | Can be any brand of choice. |
Gelfoam | Henry Schein | 9083300 | "Compressed foam" in protocol. |
#10 blades | Sklar | 06-3010 | Can be any brand of choice. |
Matrigel | Corning | 354234 | "Injectable matrix" in protocol. |
Chicken anti-green fluorescent protein antibody | Millipore | AB16901 | |
Mouse RT97 hybridoma antibody | DSHB | RT97 | |
Rabbit anti-neurofilament antibody | Encor Biotechnology, Inc | PRCA-NF-H | |
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody | Dako | Z033401 | |
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11039 | |
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-11035 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21244 | |
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) | ThermoFisher Scientific | A-21236 | |
Confocal Microscopy | Nikon | clsi |