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Transplante de Schwann células dentro de conduítes de PVDF-TrFE a ponte rato necrosante tocos de medula espinhal para promover a regeneração do axônio através da abertura

Published: November 03, 2017
doi:
10.3791/56077
, , ,
1The Miami Project to Cure Paralysis,University of Miami Miller School of Medicine, 2Department of Materials Science and Engineering,New Jersey Institute of Technology, 3Department of Biomedical Engineering,New Jersey Institute of Technology, 4Department of Cell Biology,University of Miami Miller School of Medicine, 5Department of Neurological Surgery,University of Miami Miller School of Medicine

Summary

Este artigo descreve uma técnica para inserir um canal oco entre os cotos de medula espinhal após a transecção completa e preenchimento com células de Schwann (SCs) e matriz de injetável membrana basal para ponte e promover a regeneração do axônio através da abertura.

Abstract

Entre vários modelos para a lesão da medula espinhal em ratos, o modelo de contusão é o mais frequentemente usado porque é o tipo mais comum de lesão da medula espinhal humana. O modelo de transecção completa, embora não tão clinicamente relevantes como o modelo de contusão, é o método mais rigoroso para avaliar a regeneração do axônio. No modelo de contusão, é difícil distinguir regenerada de axônios germinados ou poupados devido à presença do restante post lesões no tecido. No modelo de transecção completa, um método de ponte é necessário preencher a lacuna e criar a continuidade partir o rostral para os cotos caudais para avaliar a eficácia dos tratamentos. Uma cirurgia de ponte confiável é essencial para testar as medidas de resultado, reduzindo a variabilidade devido o método cirúrgico. Os protocolos descritos aqui são usados para preparar Schwann células (SCs) e condutas antes da transplantação, transecção completa da medula espinhal torácica nível 8 (T8), insira o conduíte e transplantação SCs para a canalização. Essa abordagem também usa em situ gelificação de uma matriz de injetável membrana basal com transplante de SC que permite o crescimento do axônio melhorada entre as interfaces rostrais e caudais com o tecido do hospedeiro.

Introduction

Reparação de lesão da medula espinhal é um problema complexo e desafiador que exigirá uma estratégia de tratamento combinatória envolvendo, por exemplo, o uso de células e um biomaterial para fornecer um microambiente favorável para função CÉL transplantado e axônio regeneração no local da lesão. Hemisection1,2,3,4,5,6,7,8,9 e transecção completa10 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21,22 modelos são frequentemente usados para avaliar os efeitos das terapias pontes baseada em biomateriais. A vantagem de usar um modelo hemisection é que ele fornece mais estabilidade para construção de ponte em comparação com transecção completa. No entanto, nos modelos hemisection, é difícil provar a regeneração do axônio como um resultado do método terapêutico aplicado devido à presença de tecido poupado. O modelo de transecção completa é o método mais rigoroso para demonstrar a regeneração do axônio.

Vários materiais naturais e sintéticos têm sido estudados para uso como um gel injetável, um gel pré-formado colocados em hemisection modelos ou contusão, ou como uma conduta estruturada em hemisection ou completar modelos transecção (detalhados em23 comentários , 24 , 25). in situ gelificação de uma mistura injectável matriz/SC cria uma interface mais permissiva entre o transplante e o cabo de anfitrião para o axônio cruzamento26,27 , em comparação com implantes previamente coaguladas matriz/SC 5 , 18 , 19 , 28. em situ gelificação permitiu a matriz para contorno próximo as interfaces de host irregular, Considerando que uma conduta mais rígida e estruturada ou um gel menos moldável pré-formado não poderia. Um conduíte estruturado frequentemente fornece contato orientação e implante estabilidade em contraste com uma matriz injetável. Os protocolos aqui apresentados descrevem um procedimento cirúrgico que tira proveito de uma matriz de injetável de membrana basal (por exemplo, matrigel, consulte a Tabela de materiais, referido como injetável matriz aqui) e um condutor estruturado para Avalie a regeneração do axônio no modelo mais rigoroso de lesão da medula espinhal.

Electrospun poli-vinylidenedifluoride-trifluoroethylene (PVDF-TrFE) alinhados fibrosos ocos conduítes são usados em nossa abordagem experimental. PVDF-TrFE é um polímero piezoelétrico que gera uma carga transiente quando deformado mecanicamente e tem sido demonstrado para promover a regeneração de extensão e axônio axônio tanto em vitro29,30 e vivo em 31. eletrofiação é um método de fabricação de andaime comuns que pode rapidamente produzir confiança andaimes fibrosos, usando uma variedade de polímeros com propriedades controláveis como alinhamento de fibra, diâmetro da fibra e espessura do andaime para neural e outras aplicações32,33,34.

Numerosos estudos de SCs transplantados em sítios de lesão da medula espinhal dos ratos demonstraram tratamento eficácia5,9,18,19,20,21 ,26. Esses transplantes são neuroprotetor para o tecido circundante da lesão, reduzir o tamanho da cavidade de lesão e promover a regeneração do axônio para o sítio de lesão/transplante e mielinização dos axônios regenerados. SCs humanas podem ser autologously transplantados, uma vantagem quando comparado com a maioria dos outros neurais relacionadas com células24. Depois de uma biópsia de nervo periférico, SCs podem ser isoladas e purificadas e irá proliferar para a quantidade desejada para transplante em humanos. Transplante autólogo de SC para pacientes ferido da medula espinhal tem sido provado para ser seguro no Irã35,36,37,38, China39,40e o Estados Unidos41,,42. SCs são conhecidos para secretar numerosos fatores neurotróficos e proteínas da matriz extracelular importantes para o crescimento do axônio e desempenham um papel essencial na regeneração do axônio após a lesão de nervo periférico. Nosso objetivo aqui é descrever métodos que podem investigar projetos de canalização para melhorar o resultado da transplantação de SC em um modelo de transecção medular completa de rato.

Protocol

ratos de Fischer adulto feminino (180-200 g de peso de corpo) estão alojados de acordo com as diretrizes do NIH e USDA. O cuidado Animal institucional e Comissão de utilização (IACUC) da Universidade de Miami aprovaram todos os procedimentos animais. 1. preparação de pré-transplante preparação Conduit. Corta o conduíte para 5 mm de comprimento, usando uma lâmina #10 sob um microscópio dissecação. Nota: O diâmetro interno da canaliza?…

Representative Results

O objetivo de utilizar esta técnica cirúrgica é avaliar o uso de uma conduta estruturada e matriz injetável que maximiza a função de SC após transplante em concluído espinais necrosante. Três semanas após o transplante, os animais são pintados com paraformaldeído 4% e a coluna vertebral são grosseiramente dissecada e fixada no mesmo fixador para outro 24h. A medula espinhal é então dissecada e amostras para seções sagitais criostato são colocadas em uma solução de saca…

Discussion

O passo mais crítico na criação de um modelo eficaz de transecção é rompimento da medula espinhal em um ou dois cortes. Um intervalo de 2-2,5 mm entre os cotos rostral e caudal da medula espinhal deve estar presente no local da transecção. Os três motivos mais prováveis para tal uma lacuna não aparecendo são (1) as raízes dorsal/ventral não foram removidas corretamente, (2) a dura-máter ventral não foi removido adequadamente, e/ou (3) o animal não foi corretamente posicionado no rolo colocado abaixo dela…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Gostaríamos de agradecer o vetor Viral e núcleos de Animal no projeto de Miami para cura paralisia produzindo lenti-GFP-vírus e fornecendo cuidados com animais, respectivamente e o histologia e núcleos de imagens para o uso do criostato, microscópio confocal, e microscópio fluorescente com investigador estéreo. Financiamento foi fornecido pelo NINDS (09923), DOD (W81XWH-14-1-0482) e NSF (DMR-1006510). M.B. Bunge é a Christine E Lynn Distinguished Professor de neurociência.

Materials

Cryogenic vials ThermoFisher Scientific 5000-0020
10 cm Petri dish VWR 25382-428
Dulbecco's modified Eagle's medium: nutrient mixture F-12 ThermoFisher Scientific 11039-021 "DMEM/F12" in protocol.
Penicillin-streptomycin ThermoFisher Scientific 15140-122 "Pen/Strep" in protcol.
Fetal bovine serum Hyclone SH300-70-03 "FBS" in protocol.
Pituitary extract Biomedical Technologies BT-215
Forskolin Sigma-Aldrich F6886
Heregulin R&D Systems 396-HB/CF
Poly L-lysine Sigma-Aldrich P2636 "PLL" in protocol.
Dulbecco's modified Eagle's medium ThermoFisher Scientific 11965-092 "DMEM" in protocol.
Hank's balanced salt solution ThermoFisher Scientific 14170-112 "HBSS" in protocol.
Tryspin-EDTA ThermoFisher Scientific 15400-054
Female Fischer rat (160-180g) Envigo
Vannas scissor, straight FST 15018-10
Ketamine Vedco Inc 5098976106 100 mg/ml
Xylazine Lloyd Inc AnaSed 20 mg/ml
Gentamycin APP Pharmaceuticals NDC 63323-010-02 Can be any brand of choice.
Micro Spatula FST 10089-11 Can be any brand of choice.
Curved scissors with blunt end FST 14017-18 Can be any brand of choice.
Blunt forceps FST 11006-12 Can be any brand of choice.
rongeur FST 16121-14 Can be any brand of choice.
Angled spring scissors FST 15006-09 Can be any brand of choice.
Absorption triangles FST 18105-03 Can be any brand of choice.
Gelfoam Henry Schein 9083300 "Compressed foam" in protocol.
#10 blades Sklar 06-3010 Can be any brand of choice.
Matrigel Corning 354234 "Injectable matrix" in protocol.
Chicken anti-green fluorescent protein antibody Millipore AB16901
Mouse RT97 hybridoma antibody DSHB RT97
Rabbit anti-neurofilament antibody Encor Biotechnology, Inc PRCA-NF-H
Polyclonal Rabbit anti-Glial Fibrillary Acidic Protein antibody Dako Z033401
Alexa Fluor 488 goat anti-chicken IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11039
Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-11035
Alexa Fluor 647 goat anti-rabbit IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21244
Alexa Fluor 647 goat anti-mouse IgG (H+L) ThermoFisher Scientific A-21236
Confocal Microscopy Nikon clsi
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References

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Lee, Y., Wu, S., Arinzeh, T. L., Bunge, M. B. Transplantation of Schwann Cells Inside PVDF-TrFE Conduits to Bridge Transected Rat Spinal Cord Stumps to Promote Axon Regeneration Across the Gap. J. Vis. Exp. (129), e56077, doi:10.3791/56077 (2017).
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