De aorta Ring mede cultuur Assay: Een handig hulpmiddel om te beoordelen van het potentieel van de Angiogenic van mesenchymale stromale cellen In Vitro
Summary
Hier presenteren we een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring waar prelabelled mesenchymale cellen zijn mede gekweekte met rat aorta afkomstige endothelial netwerken. Deze nieuwe methode kunt visualisatie van mesenchymale stromale cellen (MSCs) homing en integratie met endothelial netwerken, kwantificering van netwerkeigenschappen en evaluatie van MSC immunophenotypes en gen-expressie.
Abstract
Angiogenese is een complexe, sterk gereguleerde proces dat verantwoordelijk is voor de verlening en de handhaving van adequate weefsel perfusie. Onvoldoende therapieën onderhoud en pathologische misvormingen kunnen leiden tot ernstige ischemische ziekten, terwijl al te overvloedige vasculaire ontwikkeling geassocieerd met kanker en inflammatoire aandoeningen wordt. Een veelbelovende vorm van pro-angiogenic therapie is het gebruik van angiogenic cel broncodes, welke regelgevende factoren evenals fysieke ondersteuning bieden kan voor de ontwikkeling van nieuwe therapieën.
Mesenchymale stromale cellen (MSCs) zijn uitgebreid onderzochte kandidaten voor vasculaire regeneratie als gevolg van de effecten van hun paracrine en hun vermogen op te sporen en de thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels. In het bijzonder, eerste trimester menselijke navelstreng gerelateerde cellen (FTM HUCPVCs) zijn een zeer veelbelovende kandidaat als gevolg van hun pericyte-achtige eigenschappen, hoge proliferatieve en multilineage potentieel immuun-bevoorrechte eigenschappen en robuuste paracrine Profiel. Om te kunnen beoordelen effectief angiogenic regeneratieve cellen, is het een vereiste om hen in betrouwbare en ‘vertaalbare ‘ redactionele preklinische testen te testen. De bepaling van de aorta ring is een ex vivo angiogenese model dat zorgt voor gemakkelijk kwantificeren van de tubulaire endothelial structuren, biedt accessoire ondersteunende cellen en extracellulaire matrix (ECM) van de host, uitsluit van inflammatoire componenten en is snel en goedkoop op te zetten. Dit is voordelig in vergelijking met in vivo modellen (bijvoorbeeld, hoornvlies assay, Matrigel plug assay); de aorta ring test kan volgen van de door de overheid gereguleerde cellen en intercellulaire interacties observeren terwijl het vermijden van xeno-immuun afwijzing.
Presenteren we een protocol voor een nieuwe toepassing van de bepaling van de aorta ring, waarin menselijke MSCs in co culturen met ontwikkelingslanden rat aorta endothelial netwerken. Deze bepaling voorziet in de analyse van de bijdrage van de MSC aan tube vorming en ontwikkeling door middel van fysieke pericyte-achtige interacties en van hun potentie voor het actief migreren naar sites van angiogenese, en voor de evaluatie van hun vermogen uit te voeren en bemiddelen ECM verwerking. Dit protocol bevat verdere informatie over wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur.
Introduction
Het complexe proces van angiogenese verbetert en onderhoudt perfusie van het weefsel door het stimuleren van nieuw bloed vaartuig ontwikkeling van reeds bestaande therapieën1. Het is een stevig gereglementeerde, evenwichtige proces door pro-angiogenic en anti-angiogenic factoren. Elke tekortkoming in dit systeem kan leiden tot onvoldoende schip onderhoud of groei, waardoor ernstige ischemische ziekten met inbegrip van het myocard en vaatziekten, beroerte en neurodegeneratieve aandoeningen. Echter is overdreven vasculaire ontwikkeling kenmerkend voor aandoeningen zoals kanker en inflammatoire aandoeningen,2.
Het ontwikkelen van therapieën die gericht zijn op het bepalen van de angiogenese om gunstige weefselregeneratie is van cruciaal belang. Ondanks uitgebreide preklinische en klinische onderzoeken, zijn pogingen ter stimulering van de angiogenese met behulp van pro-angiogenic factoren en microRNAs mislukt om de gewenste resultaten3,4,5. Mogelijke redenen voor de tijdelijke effecten omvatten: beperkte levensduur van angiogenic proteïnen en nucleïnezuren, en het eindige aantal gerichte groeifactoren6,7. Hoewel oplosbaar angiogenic factoren essentieel zijn voor het initiëren van angiogenese, afhankelijk het onderhoud en de functionaliteit van therapieën van ondersteuning van celtypen, met inbegrip van pericytes en gladde spier cellen8. Het gebied van pro-angiogenic therapieën onderzoekt nu potentiële stamcellen en progenitor cel bronnen waarmee angiogenic factoren lokaal, terwijl het fysiek ondersteunen van nieuw ontwikkelde therapieën, zelf vernieuwen of zelfs differentiëren in Endotheel-achtige cellen9,10. Het vinden van de optimale angiogenic celtypes met het vermogen om te voldoen aan deze functionele eisen houdt een grote belofte voor ischemische weefselregeneratie.
Om met succes vertalen potentiële cel-gebaseerde therapieën in de klinische proeven, moeten pre-klinische studies hun doelmatigheid aan te tonen en markeer de onderliggende mechanismen van de angiogenic. Ondanks het grote aantal gevestigde angiogenese testen, ontbreekt het veld een “gouden standaard” in vitro -assay die betrouwbaar kunt het evalueren van de werkzaamheid van potentiële kandidaat-cel typen11,12, 13. meeste in vitro angiogenese testen (met inbegrip van het endotheel proliferatie, migratie en buis vorming testen) meestal beoordelen de effecten van cellen of verbindingen op de endotheliale cellen phenotypical wijzigingen of differentiatie in buisvormige en netwerk structuren14,15. Terwijl deze functies essentieel voor angiogenese zijn, een ‘vertaalbare ‘ redactionele assay ook moet evalueren: 1) de vergroting of de vervanging van de ondersteunende celtypen, met inbegrip van pericytes of zachte spiercellen, 2) de verwerking van ECM en/of kelder membraan, en 3). de efficiëntie ter bevordering van de vorming van functionele microvasculature. In vivo angiogenese-modellen, met inbegrip van de cornea assay en Matrigel plug assay, de unieke in-vivo -communicatie recapituleren maar worden uitgedaagd door de moeilijkheid van tracking toegediend cellen te observeren van de fysieke interacties. Bovendien, in in-vivo modellen, xeno-immuun afwijzing kan optreden tijdens het testen van potentiële allogene cel therapie kandidaten16. Ex vivo angiogenese-modellen, met name de bepaling van de aorta ring kan bieden: 1) gemakkelijk observatie en kwantificering van buisvormige structuren, 2) accessoire ondersteunende cellen, 3) ECM van host en kunstmatige leveringen, 4) uitsluiting van inflammatoire onderdelen en 5) snelle en goedkope setup17,18. Typisch, de aorta ring test kunt testen het angiogenic potentieel van kleine secretoire eiwitten, farmacologische agenten en transgene knaagdieren modellen19,20,21.
MSCs zijn veelbelovende kandidaten voor vasculaire regeneratie voornamelijk via hun paracrine-gemedieerde effecten22,23,24. MSCs is aangetoond dat ze afscheiden van belangrijke angiogenic factoren, met inbegrip van vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), insuline-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) en angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kunnen ook detecteren en thuisbasis van ischemische of ontstoken weefsels, echter, de precieze mechanismen zijn nog onderzocht. In toenemende mate ondersteunt de literatuur de hypothese dat de meeste MSCs uit gerelateerde cellen voortvloeien, mede express pericyte markeringen en zich zoals pericytes27 gedragen kunnen. HUCPVCs zijn een jonge bron van MSCs afgeleid van de gerelateerde regio van de menselijke navelstreng. Zij vertegenwoordigen een bevolking van MSCs met pericyte-achtige eigenschappen en van FTM zowel term umbilical koorden gekenmerkt. FTM HUCPVCs tonen een hoge expressie van pericyte markers, met inbegrip van CD146 en NG2, hoge proliferatieve en multilineage potentieel, immuun-bevoorrechte eigenschappen, en een robuuste paracrine profiel28weer te geven. FTM HUCPVCs zijn een ideale kandidaat celtype ter bevordering van de regeneratie van de gewonde weefsel door het bevorderen van nieuwe therapieën via hun pericyte-achtige eigenschappen.
Om te testen het angiogenic potentieel en de pericyte-achtige eigenschappen van menselijke MSCs, zijn een zeer beperkt aantal angiogenese testen beschikbaar wanneer positieve angiotropic migratie (hierna te noemen “homing”), ECM, verwerking en ontwikkeling van fysieke interacties tussen celtypes kunnen worden onderzocht, terwijl het verkrijgen van kwantitatieve gegevens over de ontwikkeling van de microvasculature.
Hierbij presenteren wij een protocol dat wordt een nieuwe toepassing van de aorta ring test beschreven. Menselijke MSCs waren mede gekweekte met ontwikkelingslanden rat afkomstige aorta endothelial netwerken te beoordelen op hun bijdrage aan de vorming, rijping en homeostase buis. Deze versie van de aorta ring assay beoordeelt het vermogen en de potentie van cel therapie kandidaten home naar sites van angiogenese, voeren en bemiddelen van ECM verwerking, en bijdragen aan endothelial buisvormige ontwikkeling door middel van vaststelling van pericyte-achtige lichamelijke interacties. Naast het kwantificeren van het netto-effect van MSCs op in vitro endothelial netwerk vorming en observeren intercellulaire interacties, wij ook geoptimaliseerd een protocol om te isoleren MSCs uit co culturen. Door het uitvoeren van cytometry van de stroom- en qPCR, is het mogelijk om te karakteriseren wijzigingen in MSC fenotype en gen-expressie na co cultuur. Als model celtypes, vergeleken we ontogenetisch vroeg (prenatale) en eind (volwassen) bronnen van menselijke MSCs: FTM HUCPVCs en menselijke beenmerg-afgeleide MSCs (BMSC), respectievelijk in de aorta ring test. Wij stellen voor dat de bepaling van de aorta ring kan worden gebruikt om te studeren het angiogenic potentieel van elk fysiek ondersteunende celtype wanneer onderzochte voor regeneratieve toepassingen van de angiogenic.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn verschillende kritieke fasen in het opzetten van een succesvolle aorta ring assay MSC co cultuur experiment. Ten eerste, de belangrijkste stappen bij het isoleren en segmenteren van de aorta zijn: 1) verkrijgen van uitsluitend het thoracale segment van aorta; 2) zorgvuldig verwijderen vertakkende bloedvaten, bindweefsel en vetweefsel en; 3) snijden zelfs secties van de aorta (~ 1 mm) te beperken van variabiliteit tussen elke bepaling. Ten tweede, de succesvolle inbedding van aorta ringen in BMT is essentieel voor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs danken de volgende personeelsleden en onderzoek personeel: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai en Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
