Summary

El ensayo de co-cultivo del anillo aórtico: Una herramienta conveniente para evaluar el potencial angiogénico de las células mesenquimales estromales In Vitro

Published: September 18, 2017
doi:

Summary

Aquí, presentamos un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico donde prelabelled las células mesenquimales son cultivadas conjuntamente con redes endotelial derivado de aorta de rata. Este novedoso método permite la visualización de autoguiado hacia el blanco las células estromales mesenquimales (MSCs) y la integración con redes endoteliales, cuantificación de propiedades de red y la evaluación del MSC immunophenotypes y expresión genética.

Abstract

La angiogénesis es un proceso complejo y altamente regulado responsable de proveer y mantener la perfusión adecuada del tejido. Mantenimiento insuficiente de la vasculatura y malformaciones patológicas pueden resultar en graves enfermedades isquémicas, mientras que demasiado abundante desarrollo vascular está asociado con cáncer y enfermedades inflamatorias. Una forma prometedora de la terapia pro-angiogénica es el uso de fuentes de células angiogénicas, que puede proporcionar factores reguladores, así como soporte físico para el desarrollo de nueva vasculatura.

Células estromales mesenquimales (MSCs) son candidatos extensivamente investigados para la regeneración vascular debido a sus efectos paracrinos y su capacidad para detectar y hogar de los tejidos isquémicos o inflamados. En particular, primer trimestre células perivascularias de cordón umbilical humano (FTM HUCPVCs) están un candidato muy prometedor debido a su propiedades pericyte-como, alto potencial proliferativo y del multilineage, propiedades inmunes privilegiados y paracrina robusto Perfil. Evaluar con eficacia potencialmente células regenerativas angiogénica, es un requisito para probar en confiable y ensayos preclínicos “traducible”. El ensayo del anillo aórtico es un modelo ex vivo angiogénesis que permite fácil cuantificación de estructuras endoteliales tubulares, ofrece accesorios apoyo células y matriz extracelular (ECM) del anfitrión, excluye componentes inflamatorios y es rápido y barato configurar. Esto es ventajoso en comparación con modelos en vivo (p. ej., análisis de córnea, Matrigel enchufe de ensayo); el ensayo de anillo aórtico puede seguir las células administradas y observar las interacciones intercelulares evitando xeno inmune rechazo.

Presentamos un protocolo para un uso nuevo de la prueba del anillo aórtico, que incluye MSCs humanos en co-cultivos con redes endotelial aórtica de la rata en desarrollo. Este análisis permite el análisis de la contribución de MSC para formación y desarrollo a través de interacciones físicas pericyte-como del tubo y de su potencia para activamente migrar a sitios de la angiogénesis y para evaluar su capacidad para realizar y mediar Procesamiento de ECM. Este protocolo proporciona más información sobre cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo.

Introduction

El complejo proceso de la angiogénesis mejora y mantiene la perfusión del tejido de sangre nueva buque promoción de las preexistentes vasculatura1. Es un proceso estrechamente regulado y equilibrado por factores pro-angiogénicos y antiangiogénicos. Cualquier deficiencia en este sistema puede llevar a buque insuficiente mantenimiento o crecimiento, causando graves enfermedades isquémicas, incluyendo enfermedad miocardio, accidente cerebrovascular y trastornos neurodegenerativos. Sin embargo, el exagerado desarrollo vascular es característica para condiciones como cáncer y trastornos inflamatorios2.

Desarrollo de terapias que tienen como objetivo controlar la angiogénesis para lograr regeneración tisular favorable es de importancia clave. A pesar de extensas investigaciones preclínicas y clínicas, intentos para estimular la angiogénesis mediante microRNAs y factores pro-angiogénicos han fracasado para lograr los resultados deseados3,4,5. Posibles razones de los efectos transitorios incluyen: longevidad limitada de proteínas angiogénicas y ácidos nucleicos y el finito número de objetivo de6,de factores de crecimiento7. Aunque factores angiogénicos solubles son esenciales para iniciar la angiogénesis, el mantenimiento y la funcionalidad de vasculatura dependen de apoyo tipos de células incluyendo células de pericitos y músculo liso8. El campo de la favorable-angiogenic terapias ahora está explorando fuentes potenciales de células madre y progenitoras celulares que pueden proporcionar factores angiogénicos localmente, mientras que apoyar físicamente recién desarrollado vasculatura, uno mismo-renovar o incluso diferenciarse en las células endoteliales como9,10. Encontrar la óptima angiogénicos tipos celulares con la capacidad para cumplir con estos requisitos funcionales sostiene una gran promesa para la regeneración de tejido isquémico.

Con el fin de traducir con éxito terapias basadas en células potenciales en ensayos clínicos, los estudios preclínicos necesitan demostrar su eficacia y resaltar los mecanismos angiogénicos subyacentes. A pesar del alto número de ensayos de angiogénesis establecida, el campo carece de un análisis de “estándar de oro” en vitro que confiablemente podría evaluar la eficacia del potencial candidato célula tipos11,12, 13. mayoría en vitro angiogénesis ensayos (incluyendo los ensayos de formación endoteliales de proliferación, migración y tubo) por lo general evaluación los efectos de las células o compuestos en cambio fenotípico o diferenciación en células endoteliales tubulares y estructuras de red14,15. Mientras que estas características son esenciales para la angiogénesis, también debe de evaluar un ensayo “traducible”: 1) el aumento o reemplazo de los tipos celulares soporte incluyendo pericitos o células musculares lisas, 2) el proceso del ECM o la membrana del sótano, y 3). la eficiencia para promover la formación de microvascularización funcional. En vivo modelos de angiogénesis, incluyendo la córnea ensayo y ensayo de tapón de Matrigel, recapitulan el microambiente único en vivo pero se enfrentan con la dificultad de seguimiento administrado células para observar interacciones físicas. Además, en modelos en vivo , xeno inmune rechazo puede ocurrir durante la prueba de potencial de candidatos de terapia allogeneic de la célula16. Ex vivo modelos de angiogénesis, particularmente el ensayo del anillo aórtico puede proporcionar: 1) la fácil observación y cuantificación de estructuras tubulares, células de apoyo 2) accesorias, 3) ECM de acogida y de fuentes artificiales, 4) exclusión de inflamatoria componentes y 5) configuración rápida y barata17,18. Por lo general, el ensayo de anillo aórtico puede probar el potencial angiogénico de pequeñas proteínas secretoras, agentes farmacológicos y modelos de roedores transgénicos19,20,21.

MSCs son candidatos prometedores para la regeneración vascular principalmente a través de sus efectos paracrina mediada22,23,24. MSCs se ha demostrado que secretar factores angiogénicos clave como Factor de crecimiento endotelial Vascular (VEGF), Factor de crecimiento de hepatocito (HGF), Factor de crecimiento insulínico-1 (IGF-1), Factor de crecimiento fibroblástico (bFGF) básicos y angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs pueden también detectar y tejidos hogar de isquémico o inflamada, sin embargo, los mecanismos exactos son todavía objeto de investigación. Cada vez más, la literatura apoya la hipótesis de que MSCs mayoría surgen de células perivasculares, co expresan pericyte marcadores, pueden comportarse como del pericitos27. HUCPVCs son una fuente joven de MSCs derivada de la región perivascular del cordón umbilical humano. Representan una población de MSCs con pericyte-como las características y se han caracterizado de cordón umbilical FTM y término. HUCPVCs FTM demuestran una alta expresión de marcadores pericyte incluyendo propiedades de privilegio inmunitario CD146 y NG2, alto potencial proliferativo y del multilineage y mostrar un perfil robusto paracrina del28. HUCPVCs FTM son un tipo de célula del candidato ideal para promover la regeneración del tejido lesionado mediante la promoción de nueva vasculatura a través de sus propiedades pericyte-como.

Para probar el potencial angiogénico y pericyte-como propiedades de MSCs humanas, un número muy limitado de ensayos de angiogénesis es migración de angiotropic disponible donde positivo (en lo sucesivo denominado el “homing”), ECM procesamiento y desarrollo de la física interacciones entre tipos de células pueden investigarse, mientras que la obtención de datos cuantitativos en el desarrollo de la microvascularización.

Por este medio presentamos un protocolo que describe un uso nuevo del ensayo de anillo aórtico. MSCs humanos fueron cultivadas conjuntamente con redes endoteliales aórticas derivados de rata en desarrollo para evaluar su contribución a la formación, maduración y homeostasis del tubo. Esta versión del ensayo de anillo aórtico evalúa la capacidad y la potencia de los candidatos de terapia celular inicio a sitios de la angiogénesis, realizar median el procesamiento de ECM y contribuir al desarrollo tubular endotelial mediante el establecimiento de pericyte-como física interacciones. Además de cuantificar el efecto neto de MSCs en vitro formación red endotelial y la observación de las interacciones intercelulares, nosotros también optimizado un protocolo para aislar MSCs de co-cultivos. Mediante qPCR y citometría de flujo, es posible caracterizar cambios en MSC fenotipo y expresión genética después de co-cultivo. Como tipos de la célula del modelo, se compararon ontogeneticamente temprano (prenatal) y últimas fuentes (adultas) de MSCs humanos: mAh HUCPVCs y humanas derivadas de la médula ósea MSCs (CMMo), respectivamente, en el análisis del anillo aórtico. Proponemos que el ensayo de anillo aórtico puede utilizarse para estudiar el potencial angiogénico de cualquier tipo de célula física apoyo cuando bajo investigación para aplicaciones regenerativas angiogénicos.

Protocol

todos los estudios que involucran animales fueron realizados e informados según llegar directrices 29. Todos los estudios fueron realizados con la aprobación de la Junta de investigación institucional ética (número de REB 4276). Animales todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de cuidado Animal de la red de salud de la Universidad (Toronto, Canadá), y todos los animales recibieron atención humanitaria conforme a la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratori…

Representative Results

El mismo flujo de trabajo para establecer el ensayo de co-cultivo anillo aórtico/MSC se demuestra en la figura 1. Los pasos principales son: la rata aorta aislamiento, seccionamiento y fijación de los anillos aórticos, monitoreo de brotes endoteliales y desarrollo de la red y finalmente etiquetado y administrar las MSCs. La línea de tiempo del análisis de red endotelial describe la ventana para el análisis factible para cada período de co-cultivo: día…

Discussion

Hay varias etapas críticas en la creación de un ensayo de anillo aórtico exitoso experimento de cocultivo MSC. En primer lugar, los pasos más importantes cuando aislar y seccionar la aorta son: 1) obtener exclusivamente el segmento torácico de la aorta; 2) con cuidado quitar la ramificación de los vasos sanguíneos, conjuntivo y tejido adiposo y; 3) cortar hasta secciones de la aorta (~ 1 mm) para limitar la variabilidad entre cada ensayo. En segundo lugar, la incorporación exitosa de anillos aórticos en BME es f…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores agradecemos a los siguientes funcionarios y personal de investigación: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai y Sarah Laronde.

Materials

Alpha-MEM Gibco 12571071 For FTM HUCPVC and BMSC culture media.
APC-conjugated anti human TRA-1-85 R&D Systems FAB3195A Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting
Basal membrane extract (BME) (Matrigel) Corning 354234 For aorta embedding
Bullet-kit Lonza CC-3162 Includes: Gentamicin/Amphotericin-B
(GA)human Epidermal
Growth Factor (hEGF); Vascular
Endothelial Growth Factor (VEGF); R3-
Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1);
Ascorbic Acid; Hydrocortisone;
human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum
(FBS). Required to prepare EGM
CellTracker Green CMFDA Dye Thermo-fisher C2925 For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs
CKX53 Culture Microscope Olympus For bright-field imaging of endothelial network development
Countess automated cell counter Invitrogen C10227 Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR
Dispase StemCell technologies 7923 For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C)
Disposable sterile scalpels VWR 21909-654 For sectioning aorta
Dulbecco's phosphate buffered saline Sigma-Aldrich D8537 PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride
Endothelial basal media (EBM) Lonza CC-3156 Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS
Ethanol, 70%, Biotechnology Grade VWR 97064-768 To sterilize surfaces
EVOS Life Technologies In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration
Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) GE Healthcare SH3039603 Serum component of cell culture medium
FITC-conjugated anti-CD31 antibody BD 558068 Human endothelial marker for flow cytometry
FITC-conjugated anti-CD146antibody BD 560846 Human pericyte marker for flow cytometry
Forceps Almedic 7727-A10-704 For handing rat tissue. Can use any similar forceps
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Life Technologies 14175-094 1X Without calcium chloride and magnesium chloride
HERAcell 150i CO2 Incubator Thermo Fisher Scientific 51026410 For incubating cells
Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array Qiagen PAHS-024Z Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction
ImageJ Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin
LSR II BD UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry.
MoFlo Astrios Beckman Coulter UHN SickKids FC Facility. For cell sorting.
Penicillin/streptomycin Gibco 15140122 Antibiotic component to buffers and cell culture medium
RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA purification. Includes cell lysis buffer
RT2Easy First Strand Kit Qiagen 330421 For preparation of cDNA for qPCR
RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit Qiagen 330451 Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA
Surgical scissors Fine Science Tools 14059-11 For cutting skin, muscle and aorta
Sterile gauze VWR 3084 To dampen and sterilize chest fur
TrypleE Thermo Fisher Scientific 12605036 MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C
0.2 μm pore filtration unit Thermo Fisher Scientific 566-0020 To sterilize tissue culture media
0.25% Trypsin/EDTA Gibco 25200056 For cell dissociation, pre-warm at 37 °C
10 cm tissue culture dishes Corning 25382-428 For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture
12 well-cell culture plates Corning-Sigma Aldrich CLS3513 For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures
15 mL tube BD Falcon 352096 For general tissue culture procedures
70 μm cell strainer Fisherbrand 22363548 To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting

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Iqbal, F., Gratch, Y. S., Szaraz, P., Librach, C. L. The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (127), e56083, doi:10.3791/56083 (2017).

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