महाधमनी अंगूठी सह संस्कृति परख: एक सुविधाजनक उपकरण में Mesenchymal Stromal कोशिकाओं की Angiogenic क्षमता का आकलन करने के लिए इन विट्रो
Summary
यहां, हम महाधमनी अंगूठी परख के एक उपंयास आवेदन वर्तमान जहां mesenchymal कोशिकाओं के साथ सह रहे है-महाधमनी endothelial नेटवर्क व्युत्पंन चूहे के साथ संस्कृति । इस उपंयास विधि Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) डाक और endothelial नेटवर्क, नेटवर्क संपत्तियों के ठहराव के साथ एकीकरण के दृश्य की अनुमति देता है, और एमएससी immunophenotypes और जीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन ।
Abstract
Angiogenesis एक जटिल, अत्यधिक विनियमित प्रक्रिया प्रदान करने और पर्याप्त ऊतक छिड़काव को बनाए रखने के लिए जिंमेदार है । अपर्याप्त vasculature रखरखाव और रोग विकृतियों गंभीर कोरोनरी रोगों में परिणाम कर सकते हैं, जबकि पीढ़ी प्रचुर नाड़ी विकास कैंसर और भड़काऊ विकारों के साथ जुड़ा हुआ है । प्रो angiogenic थेरेपी के एक होनहार फार्म angiogenic सेल सूत्रों का उपयोग है, जो विनियामक कारकों के साथ ही नव विकासशील vasculature के लिए भौतिक समर्थन प्रदान कर सकते हैं ।
Mesenchymal Stromal कोशिकाओं (MSCs) बड़े पैमाने पर अपने paracrine प्रभाव और पता लगाने और कोरोनरी या सूजन के ऊतकों को घर की क्षमता के कारण संवहनी उत्थान के लिए उंमीदवारों की जांच कर रहे हैं । विशेष रूप से, पहली तिमाही मानव गर्भनाल perivascular कोशिकाओं (FTM HUCPVCs) अपने pericyte की तरह गुण, उच्च प्रफलन और multilineage क्षमता, प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त गुणों के कारण एक उच्च होनहार उम्मीदवार हैं, और मजबूत paracrine प्रोफ़ाइल. प्रभावी रूप से संभावित angiogenic अपक्षयी कोशिकाओं का मूल्यांकन करने के लिए, यह एक उन्हें विश्वसनीय और “अनुवाद योग्य” पूर्व नैदानिक परख में परीक्षण करने के लिए अपेक्षित है. महाधमनी अंगूठी परख ट्यूबलर endothelial संरचनाओं के आसान ठहराव के लिए अनुमति देता है कि एक पूर्व vivo angiogenesis मॉडल है, मेजबान से गौण सहायक कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स (ECM) प्रदान करता है, भड़काऊ घटकों शामिल नहीं है, और तेजी से और सस्ती स्थापित करने के लिए । यह लाभप्रद है जब vivo में मॉडल (जैसे, corneal परख, Matrigel प्लग परख) की तुलना में; महाधमनी अंगूठी परख प्रशासित कोशिकाओं को ट्रैक कर सकते है और सेलुलर बातचीत का पालन करते हुए एक्सो से परहेज-प्रतिरक्षा अस्वीकृति ।
हम महाधमनी अंगूठी परख, जो चूहे महाधमनी endothelial नेटवर्क के विकास के साथ सह संस्कृतियों में मानव MSCs शामिल है के एक उपंयास आवेदन के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद हैं । यह परख pericyte के माध्यम से ट्यूब गठन और विकास के लिए एमएससी योगदान के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है-बातचीत और उनकी शक्ति की तरह सक्रिय रूप से angiogenesis की साइटों के लिए पलायन के लिए, और उनके प्रदर्शन और मध्यस्थता करने की क्षमता के मूल्यांकन के लिए ECM प्रोसेसिंग. यह प्रोटोकॉल एमएससी phenotype और जीन अभिव्यक्ति निंनलिखित सह संस्कृति में परिवर्तन पर अधिक जानकारी प्रदान करता है ।
Introduction
angiogenesis की जटिल प्रक्रिया में सुधार और पूर्व मौजूदा vasculature1से नए रक्त वाहिका विकास को बढ़ावा देने के द्वारा ऊतक छिड़काव बनाए रखता है । यह समर्थक angiogenic और विरोधी angiogenic कारकों द्वारा एक कसकर विनियमित, संतुलित प्रक्रिया है । इस प्रणाली में कोई कमी अपर्याप्त पोत रखरखाव या वृद्धि करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, रोधगलन रोग, स्ट्रोक, और neurodegenerative विकारों सहित गंभीर कोरोनरी रोगों के कारण. हालांकि, अतिरंजित संवहनी विकास की स्थिति के लिए विशेषता है सहित कैंसर और भड़काऊ विकारों2.
उपचार है कि angiogenesis नियंत्रण के लिए अनुकूल ऊतक पुनर्जनन प्राप्त करने के उद्देश्य महत्वपूर्ण महत्व का है विकासशील । व्यापक नैदानिक और नैदानिक जांच के बावजूद, समर्थक angiogenic कारकों और microRNAs का उपयोग कर angiogenesis को उत्तेजित करने के लिए वांछित परिणाम3,4,5प्राप्त करने में विफल रहे हैं । क्षणिक प्रभाव के लिए संभावित कारणों में शामिल हैं: angiogenic प्रोटीन और न्यूक्लिक एसिड की सीमित दीर्घायु, और लक्षित विकास कारकों की परिमित संख्या6,7. हालांकि घुलनशील angiogenic कारकों angiogenesis की शुरुआत के लिए आवश्यक हैं, रखरखाव और vasculature की कार्यक्षमता pericytes और चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं8सहित सेल प्रकार के समर्थन पर निर्भर करते हैं । प्रो angiogenic चिकित्सा के क्षेत्र में अब संभावित स्टेम सेल और जनक सेल सूत्रों है कि angiogenic कारकों स्थानीय रूप से प्रदान कर सकते है तलाश है, जबकि शारीरिक रूप से नए विकसित vasculature, आत्म नवीकरण या यहां तक कि में अंतर का समर्थन endothelial-की तरह कोशिकाओं9,10। इन कार्यात्मक आवश्यकताओं को पूरा करने की क्षमता के साथ इष्टतम angiogenic सेल प्रकार ढूँढना कोरोनरी ऊतक पुनर्जनन के लिए एक महान वादा रखती है ।
आदेश में सफलतापूर्वक नैदानिक परीक्षणों में संभावित कोशिका आधारित उपचारों का अनुवाद करने के लिए, पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए अपने प्रभावकारिता प्रदर्शन और अंतर्निहित angiogenic तंत्र पर प्रकाश डाला की जरूरत है । स्थापित angiogenesis परख की उच्च संख्या के बावजूद, क्षेत्र का अभाव इन विट्रो परख कि मज़बूती से संभावित उंमीदवार सेल प्रकार11,12की प्रभावकारिता का मूल्यांकन सकता है में एक “सोने की मानक”, 13. इन विट्रो angiogenesis परख (endothelial प्रसार, प्रवास और ट्यूब गठन की परख सहित) आम तौर पर कोशिकाओं या यौगिकों के प्रभाव का आकलन endothelial ‘ कोशिकाओं phenotypical परिवर्तन या में भेदभाव ट्यूबलर और नेटवर्क संरचनाएं14,15। हालांकि इन सुविधाओं angiogenesis के लिए महत्वपूर्ण हैं, एक “अनुवाद” परख भी मूल्यांकन करना चाहिए: 1) वृद्धि या pericytes या चिकनी मांसपेशी कोशिकाओं, 2) ECM के प्रसंस्करण और/या तहखाने झिल्ली सहित समर्थन सेल प्रकार के प्रतिस्थापन, और 3) कार्यात्मक microvasculature के गठन को बढ़ावा देने के लिए दक्षता । vivo angiogenesis मॉडल, जिसमें corneal परख और Matrigel प्लग की परख शामिल है, में vivo microenvironment में अद्वितीय दोहराऊंगा लेकिन शारीरिक बातचीत का पालन करने के लिए प्रशासित कोशिकाओं पर नज़र रखने की कठिनाई से चुनौती दी है । इसके अलावा, में vivo मॉडल, एक्सो-प्रतिरक्षा अस्वीकृति हो सकता है जबकि परीक्षण संभावित allogeneic सेल थेरेपी के उंमीदवारों16। पूर्व vivo angiogenesis मॉडल, विशेष रूप से महाधमनी अंगूठी परख प्रदान कर सकते हैं: 1) आसान अवलोकन और ट्यूबलर संरचनाओं के ठहराव, 2) गौण सहायक कोशिकाओं, 3) मेजबान और कृत्रिम आपूर्ति से ECM, 4) भड़काऊ के अपवर्जन अवयव, और 5) त्वरित और सस्ती सेटअप17,18। आमतौर पर, महाधमनी अंगूठी परख छोटे स्रावी प्रोटीन की angiogenic क्षमता का परीक्षण कर सकते हैं, औषधीय एजेंटों, और ट्रांसजेनिक कुतर मॉडल19,20,21।
MSCs अपने paracrine के माध्यम से संवहनी पुनर्जनन के लिए होनहार उंमीदवारों रहे है मुख्य रूप से मध्यस्थता प्रभाव22,23,24। MSCs प्रमुख angiogenic कारकों को स्रावित करने के लिए दिखाया गया है संवहनी Endothelial वृद्धि कारक सहित (वीईजीएफ़), Hepatocyte वृद्धि कारक (एचजीएफ), इंसुलिन जैसे विकास कारक-1 (IGF-1), बुनियादी Fibroblast वृद्धि कारक (bFGF), और angiopoeitin-1 (आंग-1)25 ,26. MSCs भी पता लगाने और कोरोनरी या सूजन ऊतकों को घर कर सकते हैं, हालांकि, सटीक तंत्र अभी भी जांच के तहत कर रहे हैं । तेजी से, साहित्य परिकल्पना का समर्थन करता है कि अधिकांश MSCs perivascular कोशिकाओं, सह-एक्सप्रेस pericyte मार्कर से उत्पन्न होते हैं, और pericytes27की तरह व्यवहार कर सकते हैं । HUCPVCs मानव गर्भनाल के perivascular क्षेत्र से व्युत्पंन MSCs के एक युवा स्रोत हैं । वे pericyte की तरह गुणों के साथ MSCs की आबादी का प्रतिनिधित्व करते है और दोनों FTM और अवधि गर्भनाल से विशेषता है । FTM HUCPVCs CD146 और NG2, उच्च प्रफलन और multilineage क्षमता, प्रतिरक्षा-विशेषाधिकार प्राप्त गुणों सहित pericyte मार्करों की एक उच्च अभिव्यक्ति का प्रदर्शन, और एक मजबूत paracrine प्रोफ़ाइल28प्रदर्शित करते हैं । FTM HUCPVCs एक आदर्श उंमीदवार सेल प्रकार के नए vasculature के संवर्धन के माध्यम से घायल ऊतक के उत्थान को बढ़ावा देने के लिए अपने pericyte तरह गुण हैं ।
angiogenic क्षमता और मानव MSCs, angiogenesis परख की एक बहुत ही सीमित संख्या के गुण की तरह परीक्षण उपलब्ध है जहां सकारात्मक angiotropic प्रवास (इसके बाद “डाक” के रूप में संदर्भित), ECM प्रसंस्करण, और शारीरिक के विकास microvasculature विकास पर मात्रात्मक डेटा प्राप्त करते समय कक्ष प्रकारों के बीच इंटरैक्शन की जांच की जा सकती है.
इसके द्वारा हम एक प्रोटोकॉल है कि महाधमनी अंगूठी परख के एक उपंयास आवेदन का वर्णन प्रस्तुत करते हैं । मानव MSCs चूहे के विकास के साथ सह-प्रसंस्कृत थे-व्युत्पंन महाधमनी endothelial नेटवर्क ट्यूब गठन, परिपक्वता के लिए उनके योगदान का आकलन करने के लिए, और homeostasis । महाधमनी अंगूठी परख के इस संस्करण की क्षमता और सेल थेरेपी के उंमीदवारों की शक्ति का आकलन करने के लिए घर angiogenesis की साइटों, प्रदर्शन और मध्यस्थता ECM प्रसंस्करण, और endothelial ट्यूबलर विकास के लिए योगदान की स्थापना के माध्यम से pericyte-भौतिक की तरह बातचीत. इन विट्रो endothelial नेटवर्क गठन और देख सेलुलर बातचीत में पर MSCs के शुद्ध प्रभाव को बढ़ाता है के अलावा, हम भी सह संस्कृतियों से MSCs को अलग करने के लिए एक प्रोटोकॉल अनुकूलित । प्रवाह cytometry और qPCR प्रदर्शन करके, यह एमएससी phenotype में परिवर्तन की विशेषता संभव है और सह संस्कृति के बाद जीन अभिव्यक्ति । मॉडल सेल प्रकार के रूप में, हम ontogenetically की तुलना में जल्दी (जंम के पूर्व) और स्वर्गीय (वयस्क) मानव MSCs के सूत्रों: FTM HUCPVCs और मानव अस्थि मज्जा-MSCs (BMSC), क्रमशः महाधमनी अंगूठी परख में व्युत्पंन । हम प्रस्ताव है कि महाधमनी अंगूठी परख के लिए किसी भी शारीरिक रूप से समर्थन सेल प्रकार की angiogenic क्षमता का अध्ययन किया जा सकता है जब angiogenic अपक्षयी अनुप्रयोगों के लिए जांच के तहत ।
Protocol
पशुओं से जुड़े सभी अध्ययनों का आयोजन किया गया और आने वाले दिशानिर्देशों के अनुसार रिपोर्ट की गई 29 . सभी अध्ययनों संस्थागत अनुसंधान नैतिकता बोर्ड अनुमोदन (REB संख्या ४२७६) के साथ प्रदर्?…
Representative Results
Discussion
वहां एक सफल महाधमनी अंगूठी परख एमएससी सह संस्कृति प्रयोग स्थापित करने में कई महत्वपूर्ण चरणों रहे हैं । पहला, सबसे महत्वपूर्ण कदम जब अलग और महाधमनी के खंड कर रहे हैं: 1) महाधमनी के वक्ष खंड विशेष रूप से प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक निंनलिखित स्टाफ के सदस्यों और अनुसंधान कर्मियों का धंयवाद: Andrée Gauthier-फिशर, मैथ्यू Librach, तान्या Barretto, Tharsan Velauthapillai, और सारा Laronde ।
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
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