L'analisi di co-coltura di anello aortico: Un comodo strumento per valutare il potenziale angiogenico delle cellule stromali mesenchimali In Vitro
Summary
Qui, presentiamo una nuova applicazione del dosaggio anello aortico dove prelabelled le cellule mesenchimali sono co-coltivate con reti endoteliali derivati dell’aorta di ratto. Questo metodo novello permette la visualizzazione di homing delle cellule stromali mesenchimali (MSCs) e integrazione con le reti endoteliale, quantificazione delle proprietà della rete e la valutazione di MSC immunophenotypes ed espressione genica.
Abstract
L’angiogenesi è un processo complesso e altamente regolato, responsabile della fornitura e del mantenimento di aspersione sufficiente del tessuto. Manutenzione insufficiente vascolarizzazione e malformazioni patologiche possono provocare gravi malattie ischemiche, mentre eccessivamente abbondante sviluppo vascolare è associato con cancro e disordini infiammatori. Una promettente forma di terapia pro-angiogenica è l’uso di fonti di cellule angiogeniche, in grado di fornire fattori di regolazione, nonché supporto fisico per lo sviluppo recente di sistema vascolare.
Cellule stromali mesenchimali (MSCs) sono candidati estesamente esaminatori per rigenerazione vascolare a causa dei loro effetti paracrini e la loro capacità di rilevare e casa ai tessuti ischemici o infiammati. In particolare, primo acetonide del cordone ombelicale cellule perivascolari (FTM HUCPVCs) sono un candidato molto promettente dovuto loro pericyte-come proprietà, alto potenziale proliferativo e multilineare, proprietà immunitario privilegiato e robusta paracrine profilo. Per valutare efficacemente potenzialmente angiogenici rigenerativa cellule, è un requisito di testare loro in affidabile e “traducibile” analisi pre-clinica. L’analisi aortica dell’anello è un ex vivo modello di angiogenesi che consente facile quantificazione delle strutture endoteliali tubolari, fornisce accessorie supporto cellule e matrice extracellulare (ECM) dall’host, esclude le componenti infiammatorie ed è veloce e poco costoso per impostare. Questo è vantaggioso rispetto ai modelli in vivo (ad es., analisi cornea, analisi della spina di Matrigel); l’analisi aortica dell’anello può seguire le cellule amministrate e osservare interazioni intercellulari, evitando il rigetto immunitario xeno.
Vi presentiamo un protocollo per una nuova applicazione del test anello aortico, che comprende MSCs umane in co-colture con sviluppo delle reti endoteliali aortiche di ratto. Questo test permette l’analisi del contributo MSC alla formazione e sviluppo attraverso interazioni fisiche pericyte-come del tubo e della loro potenza per attivamente la migrazione ai siti dell’angiogenesi e per valutare la loro capacità di eseguire e mediare Elaborazione di ECM. Questo protocollo fornisce ulteriori informazioni sulle modifiche in MSC fenotipo ed espressione genica dopo co-coltura.
Introduction
Il complesso processo di angiogenesi migliora e mantiene perfusione tissutale, promuovendo lo sviluppo dei vasi sanguigni nuovi da preesistente sistema vascolare1. È un processo strettamente regolato, equilibrato di fattori pro-angiogenici e anti-angiogenici. Qualsiasi carenza in questo sistema può portare a insufficiente manutenzione o crescita, causando gravi malattie ischemiche, compreso la malattia del miocardio, ictus e malattie neurodegenerative. Tuttavia, esagerato sviluppo vascolare è caratteristico per le condizioni compreso cancro e disordini infiammatori2.
Lo sviluppo di terapie che mirano a controllare l’angiogenesi per ottenere la rigenerazione tissutale favorevole è di fondamentale importanza. Malgrado le vaste indagini precliniche e cliniche, di stimolare l’angiogenesi utilizzando microRNA e fattori pro-angiogenici hanno fallito raggiungere i risultati voluti3,4,5. I motivi possibili per gli effetti transitori includono: mirati limitata longevità di proteine angiogeniche e acidi nucleici e il numero limitato di fattori di crescita6,7. Sebbene fattori solubili angiogenici sono essenziali per l’avvio di angiogenesi, la manutenzione e la funzionalità del sistema vascolare dipendono dal supporto di tipi delle cellule compreso le cellule muscolari lisce e periciti8. Campo delle terapie pro-angiogenica sta ora valutando potenziali fonti sulle cellule staminali e progenitrici delle cellule che potrebbero fornire fattori angiogenici localmente, mentre fisicamente sostenere appena sviluppato il sistema vascolare, autorinnovanti o anche differenziarsi in cellule endoteliali9,10. Trovare l’ottimali angiogenici tipi delle cellule con la capacità di soddisfare questi requisiti funzionali detiene una grande promessa per la rigenerazione di tessuto ischemico.
Per tradurre correttamente potenziali terapie basate sulle cellule in studi clinici, studi pre-clinici devono dimostrare la loro efficacia ed evidenziare i meccanismi angiogenetici. Nonostante l’elevato numero di saggi di angiogenesi stabilito, il campo manca un’analisi “gold-standard” in vitro che in modo affidabile è in grado di valutare l’efficacia di potenziali candidati cella tipi11,12, 13. la maggior parte in vitro saggi di angiogenesi (compresi i saggi di formazione tubo, la migrazione e la proliferazione endoteliali) in genere valutare gli effetti delle cellule o composti su cellule endothelial modifiche fenotipiche o differenziazione in tubolari e strutture di rete14,15. Mentre queste caratteristiche sono fondamentali per l’angiogenesi, un’analisi “traducibile” dovrebbe anche valutare: 1) la incremento o la sostituzione dei giustificativi tipi cellulari tra cui periciti o cellule di muscolo liscio, 2) al trattamento di ECM e/o della membrana dello scantinato, e 3). l’efficienza per promuovere la formazione di microvasculature funzionale. In vivo l’angiogenesi modelli, tra cui l’analisi cornea e l’analisi di spina di Matrigel, ricapitolano il microambiente unico in vivo ma sono sfidati dalla difficoltà di rilevamento somministrato cellule per osservare le interazioni fisiche. Inoltre, in modelli in vivo , xeno-immunitario rifiuto può verificarsi durante il test i candidati potenziali terapia di trapianto allogeneic della cellula16. Ex vivo l’angiogenesi modelli, in particolare l’analisi aortica dell’anello può fornire: 1) facile osservazione e la quantificazione delle strutture tubolari, cellule di sostegno 2) accessorie, 3) ECM da ospitare e forniture artificiale, 4) esclusione di infiammatoria componenti e 5) installazione rapida ed economica17,18. In genere, l’analisi aortica dell’anello può testare il potenziale angiogenico di piccole proteine secretorie, agenti farmacologici e modelli di roditori transgenici19,20,21.
MSCs sono promettenti candidati per la rigenerazione vascolare principalmente attraverso i loro effetti paracrini mediati22,23,24. MSCs sono stati indicati a secernere fattori angiogenici chiave compreso il fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1), basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) e angiopoietina-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs può anche rilevare e tessuti sede ischemica o infiammato, tuttavia, i meccanismi esatti sono ancora sotto indagine. Sempre più, la letteratura sostiene l’ipotesi che la maggior parte delle MSCs derivano da cellule perivascolari, co-esprimono marcatori di periciti e possono comportarsi come periciti27. HUCPVCs sono una giovane fonte di cellule staminali mesenchimali derivate dalla regione perivascolare del cordone ombelicale umano. Essi rappresentano una popolazione di cellule staminali mesenchimali con pericyte-come le proprietà e sono state caratterizzate dal cordone ombelicale sia FTM e termine. FTM HUCPVCs dimostrano un’alta espressione di marcatori Pericita incluse le proprietà immunitario privilegi CD146 e NG2, alto potenziale proliferativo e multilineare e visualizzare un profilo di paracrine robusto28. FTM HUCPVCs sono un tipo di cellula del candidato ideale per promuovere la rigenerazione del tessuto danneggiato attraverso la promozione del nuovo sistema vascolare attraverso le loro proprietà pericyte-come.
Per testare il potenziale angiogenico e pericyte-come proprietà di cellule staminali mesenchimali umane, un numero molto limitato di saggi di angiogenesi è disponibili dove positivo angiotropic migrazione (in appresso denominato “homing”), ECM elaborazione e sviluppo della fisica interazioni tra tipi cellulari possono essere studiate, durante l’acquisizione di dati quantitativi sullo sviluppo del microcircolo.
Con la presente vi presentiamo un protocollo che descrive un’applicazione novella del dosaggio anello aortico. MSCs umane erano co-coltivate con reti endoteliale aortiche ratto-derivato in via di sviluppo per valutare il loro contributo per la formazione, la maturazione e l’omeostasi del tubo. Questa versione del test anello aortico valuta la capacità e la potenza dei candidati alla terapia cellulare casa ai siti dell’angiogenesi, eseguire e mediare l’elaborazione ECM, e per contribuire allo sviluppo endoteliale tubolare stabilendo pericyte-come fisico interazioni farmacologiche. Oltre a quantificare l’effetto netto di MSCs su in vitro formazione del reticolo endoteliale e osservando le interazioni intercellulari, abbiamo ottimizzato anche un protocollo per isolare MSCs da co-colture. Eseguendo qPCR e citometria a flusso, è possibile caratterizzare i cambiamenti nell’espressione di gene e fenotipo MSC dopo co-coltura. Come tipi di cellule del modello, abbiamo confrontato ontogeneticamente presto (prenatale) e fine (adulti) fonti di cellule staminali mesenchimali umane: FTM HUCPVCs e umane derivate da midollo osseo MSCs (BMSC), rispettivamente, nell’analisi della anello aortico. Vi proponiamo l’analisi aortica dell’anello può essere utilizzato per studiare il potenziale angiogenico di qualsiasi tipo di cellula fisicamente supporto quando si è sotto inchiesta per applicazioni rigenerativa angiogenici.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diverse fasi critiche nella creazione di un successo analisi aortica dell’anello esperimento di co-coltura MSC. In primo luogo, i passaggi più importanti quando isolando e sezionamento dell’aorta sono: 1) ottenere esclusivamente il segmento toracico dell’aorta; 2) accuratamente rimuovendo ramificazione dei vasi sanguigni, tessuto connettivo e adiposo e; 3) taglio anche sezioni dell’aorta (~ 1 mm) per limitare la variabilità tra ogni dosaggio. In secondo luogo, il successo l’incorporamento degli anelli aortici i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziare i seguenti membri del personale e personale di ricerca: Sarah Laronde, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai e Andrée Gauthier-Fisher.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
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