대동맥 반지 공동 문화 분석 결과: Mesenchymal Stromal 세포에 생체 외에서 의 신생 잠재력을 평가 하는 편리한 도구
Summary
여기, 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램 prelabelled 중간 엽 세포는 쥐 대동맥 파생 내 피 네트워크와 공동 경작. 이 새로운 메서드 Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs) 유도 및 내 피 네트워크와 통합의 시각화, 네트워크 속성의 정량화 및 MSC immunophenotypes 고 진 식의 평가 수 있습니다.
Abstract
신생은 복잡 하 고, 높은 규제 프로세스를 제공 하 고 적절 한 조직 관류를 유지에 대 한 책임. 지나치게 풍부한 혈관 개발은 암 및 염증 성 질환 관련 된 부족 한 맥 관 구조 유지 보수 및 병 적인 기형 심한 허 혈 성 질환에서 발생할 수 있습니다. 프로-신생 치료의 유망한 형태 신생 셀 소스, 새로 개발 하는 맥 관 구조에 대 한 규제 요인으로 물리적 지원을 제공할 수 있는의 사용 이다.
Mesenchymal Stromal 세포 (MSCs)를 감지 하 여 허 혈 성 또는 염증 조직에 집 혈관 재생 paracrine 효과 및 그들의 능력에 대 한 광범위 하 게 조사 후보자 이다. 특히, 처음 3 달 동안 인간 탯 줄 혈관 주위 세포 (FTM HUCPVCs)는 그들의 pericyte 같은 속성, 높은 증식 및 multilineage 잠재력, 면역 권한 속성, 및 강력한 paracrine 매우 유망한 후보 프로 파일입니다. 효과적으로 평가 하 고 잠재적으로 신생 재생 세포, 그것은 그들에 신뢰할 수 있는 및 “번역” 전 임상 분석 실험 테스트는 필수 이다. 대동맥 반지 분석 결과 비보 전 신생 모델입니다 관 내 피 구조의 쉬운 정량화를 허용, 액세서리 지원 세포와 세포 외 기질 (ECM) 호스트에서 염증 구성 요소를 제외 하며는 빠르고 저렴 한 설정. 이것은 (예를 들어, 각 막 분석 결과, Matrigel 플러그 분석 결과); vivo에서 모델에 비해 유리 대동맥 반지 분석 결과 관리 셀을 추적 하 고 이종 면역 거부를 피하고 있는 동안 세포 상호 작용을 관찰할 수 있습니다.
선물이 개발 쥐 대동맥 내 피 네트워크 공동 문화에서 인간의 MSCs를 포함 하는 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램에 대 한 프로토콜. 이 분석 결과 관 형성 및 물리적 pericyte 같은 상호 작용을 통해 개발에 MSC 기여와 신생의 사이트를 적극적으로 마이그레이션하기 위한 그리고 그들의 능력을 수행 하 고 중재를 평가 하기 위한 그들의 힘의 분석에 대 한 허용 ECM 처리입니다. 이 프로토콜은 MSC 표현 형 유전자 표현 공동 문화에 따라 변화에 추가 정보를 제공 합니다.
Introduction
신생의 복잡 한 프로세스 향상 하 고 기존 맥 관 구조1에서 새로운 선박 개발을 추진 하 여 조직 관류를 유지 합니다. 프로-신생 및 안티-신생 요인에 의해 단단히 규제, 공정한 과정 이다. 어떤 결핍이이 시스템에 부족 한 선박 유지 보수 또는 성장, 심근 질환, 뇌졸중, 신경 장애 등 심각한 허 혈 성 질환을 일으키는 발생할 수 있습니다. 그러나, 과장 된 혈관 개발 조건 암, 염증 성 질환2를 포함 하 여 특징입니다.
유리한 조직 재생을 달성 하기 위해 신생을 제어 하는 것을 목표로 하는 치료를 개발 하는 것은 중요입니다. 광범위 한 전 임상 및 임상 조사에도 불구 하 고 신생 프로 신생 요인과 microRNAs를 사용 하 여 자극 하려고 원하는 결과3,,45달성 못했다. 일시적 효과 대 한 가능한 이유: 신생 단백질 및 핵 산의 한정 된 수의 제한 된 장 수 대상 성장 요인6,7. 수용 성 신생 요소는 신생을 시작에 대 한 필수, 유지 보수 및 맥 관 구조의 기능 세포 유형 pericytes 및 평활 근 세포8을 포함 하 여 지원에 따라 다릅니다. 프로-신생 요법의 분야는 지금 잠재적인 줄기 세포 그리고 조상 세포 원 맥 관 구조, 자동 갱신 또는로 차별화 개발 물리적으로 새로 지 원하는 신생 요소를 로컬로 제공할 수 있습니다 탐험 내 피 같은 셀9,10. 찾는 최적의 신생 세포 유형 이러한 기능적 요구 사항을 충족 하는 기능으로 허 혈 성 조직 재생에 대 한 위대한 약속을 보유 하고있다.
임상으로 잠재적인 세포 기반 치료를 성공적으로 번역 하기 위해 전 임상 연구 하 그들의 효능을 입증 하 고 기본 신생 메커니즘을 강조 해야 합니다. 설립 된 신생 분석 실험의 높은 숫자에도 불구 하 고 필드 “금 표준” 생체 외에서 분석 결과 안정적으로 잠재적인 후보 셀 유형11,12, 의 효능을 평가할 수 있는 부족 13. 대부분 체 외에서 신생 분석 실험 (내 피 확산, 마이그레이션 및 관 형성 분석을 포함 하 여) 일반적으로 내 피 세포의 phenotypical 변화 나 감 별 법으로 셀 또는 화합물의 효과 평가 관 및 네트워크 구조14,15. 이러한 기능은 신생에 대 한 중요 한 동안, “번역” 분석 결과 또한 평가 해야 한다: 1) 확대 또는 pericytes 또는 평활 근 세포, ECM, 지하실 막의 2) 처리를 포함 하 여 지원 세포 유형의 교체 및 3) 기능 microvasculature의 형성을 촉진 하는 효율성. 각 막 분석 결과 및 Matrigel 플러그 분석 결과를 포함 하 여 신생 모델, vivo에서 독특한 vivo에서 microenvironment을 정리 하지만 추적 관리 셀의 어려움에 의해 도전 물리적 상호 작용을 관찰 하. 또한, vivo에서 모델 이종 면역 거부 잠재 수용자 세포 치료 후보16테스트 하는 동안 발생할 수 있습니다. 신생 모델 비보 전 특히 대동맥 반지 분석 결과 제공할 수 있습니다: 1) 쉽게 관찰과 3) ECM 호스트와 인공 공급에서의 염증 성 제외 4) 관 형 구조, 2) 액세서리 지원 셀의 정량화 구성 요소, 및 5) 신속 하 고 저렴 한 설치17,18. 일반적으로, 대동맥 반지 분석 결과 작은 분 비 단백질, 약리학 대리인, 및 유전자 변형 쥐 모델19,,2021의 신생 잠재력을 테스트할 수 있습니다.
MSCs는 주로 그들의 paracrine 중재 효과22,,2324통해 혈관 재생을 위한 유망한 후보자. 혈관 내 피 성장 인자 (VEGF), Hepatocyte 성장 인자 (HGF)를 포함 한 주요 신생 요인 분 비 MSCs 보였다 인슐린 같은 성장 인자-1 (IGF-1), 기본적인 섬유 아 세포 성장 인자 (bFGF), 및 angiopoeitin-1 (중앙-1)25 ,26. 그러나 MSCs도 검색할 수 있습니다 그리고 집에 허 혈 성 또는 염증 조직, 조사를 받고 아직도, 정확한 메커니즘은. 점점, 문학 가설 대부분 MSCs 혈관 주위 세포에서 발생 하는 공동 pericyte 마커, 표현 그리고 pericytes27처럼 행동 수를 지원 합니다. HUCPVCs는 인간의 탯 줄의 혈관 주위 지역에서 파생 하는 MSCs의 젊은 소스입니다. 그들은 pericyte 같은 속성으로 MSCs의 인구를 대표 하 고 용어와 FTM 탯에서 특징. FTM HUCPVCs CD146 및 높은 증식 및 multilineage 잠재력 NG2 면역 권한 속성을 비롯 한 pericyte 마커의 높은 식 설명 하 고 강력한 paracrine 프로필28을 표시 합니다. FTM HUCPVCs pericyte 같은 속성을 통해 새로운 맥 관 구조의 프로 모션을 통해 손상 된 조직의 재생을 촉진 하는 이상적인 후보자 셀 유형입니다.
신생 잠재력과 인간의 MSCs의 pericyte 같은 속성을 테스트 하려면 신생 분석 실험의 매우 제한 된 수 있으며 사용할 수 있는 긍정적인 angiotropic 마이그레이션 (“추적” 라 함), ECM 처리, 물리의 개발 셀 형식 간의 상호 작용 microvasculature 개발에 양적 데이터를 가져오는 동안, 조사 될 수 있다.
이로써 선물이 대동맥 반지 분석 결과의 새로운 응용 프로그램을 설명 하는 프로토콜. 인간의 MSCs 공동 개발 쥐 파생 대동맥 내 피 네트워크 형성, 성숙, 및 항상성 튜브에 그들의 기여를 평가 하기 위해 경작 했다. 이 버전의 대동맥 반지 분석 결과 평가 능력과 집 신생의 사이트를 수행 하 고 ECM 처리를 중재 pericyte 같은 물리를 수립을 통해 내 피 관 개발을 세포 치료의 힘 상호 작용입니다. 생체 외에서 내 피 네트워크 형성에 MSCs의 그물 효과 측정 하 고 세포 상호 작용을 관찰, 뿐만 아니라 우리는 또한 공동 문화에서 MSCs를 분리 하는 프로토콜 최적화. Cytometry 및 정량 Pcr을 수행 하 여 특성화 MSC 표현 형 및 유전자 식 공동 문화에 따라 변화 가능 하다. 모델 셀 유형으로 우리 ontogenetically 일찍 비교 (태아)와 인간의 MSCs의 늦은 (성인) 소스: FTM HUCPVCs와 인간의 골 수 파생 된 MSCs (BMSC), 대동맥 반지 분석 결과에서 각각. 우리는 신생 재생 응용 프로그램에 대 한 조사를 받고 때 어떤 물리적으로 지 원하는 셀 형식의 신생 잠재력 연구 대동맥 반지 분석 결과 사용할 수 있습니다 제안 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
성공적인 대동맥 반지 분석 결과 MSC 공동 문화 실험 설정에 몇 가지 중요 한 단계가 있습니다. 첫째, 분리 하 고 대동맥을 구분 하는 경우 가장 중요 한 단계는: 1) 대동맥;의 독점적으로 흉부 세그먼트를 취득 2) 신중 하 게 분기 혈관, 결합 및 지방 조직 제거 및; 각 분석 결과 사이 가변성을 제한 하는 대동맥 (~ 1 m m)의 3) 절단도 섹션입니다. 둘째, 공학은으로 대동맥의 성공적인 포함은이 분석 결과 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 다음 직원을 감사 하 고 연구 인력: 앙드레 Gauthier 피셔, 매튜 Librach, 타 냐 Barretto, Tharsan Velauthapillai, 그리고 사라 Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
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