Aorta Ring samtidig kultur analysen: Ett bekvämt verktyg för att bedöma angiogena Potential mesenkymala stromaceller In Vitro
Summary
Här presenterar vi en ny tillämpning av aorta ring analysen där prelabelled mesenkymala celler är samtidig odlade med råtta aorta-derived endothelial nätverk. Denna nya metod kan visualisering av mesenkymala stromaceller (MSCs) homing och integration med endothelial nätverk, kvantifiering av Nätverksegenskaper, och utvärdering av MSC immunophenotypes och gen uttryck.
Abstract
Angiogenes är en komplex och starkt reglerad process som är ansvarig för att tillhandahålla och upprätthålla adekvat vävnadsperfusion. Otillräcklig vaskulatur underhåll och patologiska missbildningar kan resultera i svår ischemisk sjukdomar, medan alltför riklig kärlbildningsprocessen är associerad med cancer och inflammatoriska sjukdomar. En lovande form av proangiogena terapi är användningen av angiogena cell källor, som kan ge reglerande faktorer samt fysisk stöd för nyligen utveckla kärlsystemet.
Mesenkymala stromaceller (MSCs) är i stor utsträckning undersökta kandidater för vaskulär regenerering på grund av deras parakrin effekter och deras förmåga att upptäcka och hem till ischemisk eller inflammerade vävnader. Särskilt första trimestern mänskliga perivaskulär navelsträngsblod (FTM HUCPVCs) är en mycket lovande kandidat på grund av deras pericyt-liknande egenskaper, hög proliferativ och Multilinjärt potential, immun-privilegierade boenden och robust parakrin profilen. Effektivt utvärdera potentiellt angiogena regenerativa celler, är det en förutsättning att testa dem i tillförlitliga och ”översättas” pre-kliniska analyser. Aorta ring analysen är en ex vivo angiogenes modell som möjliggör enkel kvantifiering av tubulär endothelial strukturer, ger tillbehör stödjande celler och extracellulär matrix (ECM) från värden, utesluts inflammatoriska komponenter och är snabb och billig att ställa in. Detta är fördelaktigt jämfört med i vivo modeller (t.ex., korneal assay, Matrigel plug assay); aorta ring analysen kan spåra administrerade cellerna och observera intercellulära interaktioner samtidigt undvika xeno-immun avvisande.
Vi presenterar ett protokoll för en ny tillämpning av aorta ring analysen, vilket inkluderar mänskliga MSCs i samtidig kulturer med utveckla råtta aorta endothelial nätverk. Denna analys möjliggör analys av MSC bidrag till tube bildning och utveckling genom fysisk pericyt-liknande interaktioner och deras styrka för aktivt migrerar till platser av angiogenes, och för att bedöma deras förmåga att utföra och medla ECM-bearbetning. Detta protokoll ger ytterligare information om förändringar i MSC fenotyp och gen uttryck efter samtidig kultur.
Introduction
Den komplexa processen av angiogenes förbättrar och upprätthåller vävnadsperfusion genom att främja nytt blod fartyg från redan existerande kärl1. Det är en hårt reglerad, balanserad process av proangiogena och anti-angiogena faktorer. Eventuella brister i detta system kan leda till otillräcklig fartyg underhåll eller tillväxt, orsakar svår ischemisk sjukdomar inklusive hjärtinfarkt sjukdom, stroke och neurodegenerativa sjukdomar. Överdrivna kärlbildningsprocessen är emellertid karakteristiskt för villkor inklusive cancer och inflammatoriska sjukdomar2.
Utveckla terapier som syftar till att styra angiogenes för att uppnå gynnsam vävnadsregeneration är av avgörande betydelse. Trots omfattande prekliniska och kliniska undersökningar, har försök att stimulera angiogenes med hjälp av proangiogena faktorer och mikroRNA misslyckats med att uppnå önskat resultat3,4,5. Möjliga orsaker till övergående effekterna inkluderar: begränsad livslängd av angiogena proteiner och nukleinsyror och ändliga antalet riktade tillväxtfaktorer6,7. Även om lösliga angiogena faktorer är väsentliga för att initiera angiogenes, beroende underhåll och funktionalitet av kärlsystemet stödja celltyper inklusive pericyter och smidig muskel celler8. Fältet av proangiogena behandlingar nu undersöker potentiella stamceller och stamceller cell-källor som kan ge angiogena lokalt, medan fysiskt stödja nyligen utvecklat kärlsystemet, själv förnya eller ens skilja i endothelial-liknande celler9,10. Att hitta den optimala angiogena celltyper med kapacitet att uppfylla dessa funktionskrav rymmer ett stort löfte för ischemisk vävnadsregeneration.
För att framgångsrikt översätta potentiella cellbaserade terapier till kliniska prövningar, måste prekliniska studier Visa sin effekt och belysa de underliggande angiogena mekanismerna. Trots det höga antalet etablerade angiogenes analyser, fältet saknar en ”guld-standard” in vitro- test som på ett tillförlitligt sätt kan utvärdera effekten av potentiella kandidat cell typer11,12, 13. de flesta in vitro- angiogenes analyser (inklusive endothelial spridning, migration och tube bildandet analyserna) vanligtvis bedöma effekterna av celler eller föreningar på endotelceller fenotypiska förändringar eller differentiering i tubulär och nätverk strukturer14,15. Även dessa funktioner är avgörande för angiogenes, en ”översättas” assay bör också utvärdera: 1) den bröstförstoring eller utbyte av de stödjande celltyper inklusive pericyter eller glatta muskelceller, 2) behandling av ECM eller basalmembranet, och 3). effektiviteten för att främja bildandet av funktionella mikrocirkulation. In vivo angiogenes modeller, inklusive korneal assay och Matrigel plug assay, recapitulate det unika i vivo mikromiljö men utmanas av svårigheten att spåra administreras celler att iaktta fysiska interaktioner. Dessutom i i vivo modeller, kan xeno-immun avslag uppstå när du testar potentiella allogena cell terapi kandidater16. Ex vivo angiogenes modeller, särskilt aortastenos ring analysen kan ge: 1) enkel observation och kvantifiering av tubulära strukturer, (2) tillbehör stödjande celler, 3) ECM från värd och konstgjorda förnödenheter, 4) uteslutning av inflammatoriska komponenter, och 5) snabb och billig installation17,18. Typiskt, aorta ring analysen kan testa angiogena potential små sekretoriska proteiner, farmakologiska agenter och transgena djurmodeller19,20,21.
MSCs är lovande kandidater för vaskulär regenerering främst genom deras parakrin-medierade effekter22,23,24. MSCs har visat att utsöndra nyckel angiogena faktorer inklusive Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF), Hepatocyte Growth Factor (HGF), Insulin-like Growth Factor-1 (IGF-1) basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) och angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs kan också upptäcka och hem till ischemisk eller inflammerade vävnader, men de exakta mekanismerna är fortfarande under utredning. Alltmer, stöder litteraturen hypotesen att de flesta MSCs uppkommer perivaskulär celler, Co express pericyt markörer och kan bete sig som pericyter27. HUCPVCs är en ung källa av MSCs härrör från regionen perivaskulär av mänskliga navelsträngen. De representerar en befolkning av MSCs med pericyt-liknande egenskaper och har karaktäriserats från både FTM och sikt navelsträngar. FTM HUCPVCs visar ett högt uttryck av pericyt markörer inklusive CD146 och NG2, hög proliferativ och Multilinjärt potential, immun-privilegierade egenskaper, och visa en robust parakrin profil28. FTM HUCPVCs är en idealisk kandidat celltyp att främja regenerering av skadad vävnad genom främjande av nya vaskulatur via deras pericyt-liknande egenskaper.
För att testa den angiogena potential och pericyt-liknande egenskaper av mänskliga MSCs, är ett mycket begränsat antal angiogenes analyser tillgänglig där positiva angiotropic migration (hädanefter benämnd ”homing”), ECM bearbetning och utveckling av fysiska interaktioner mellan celltyper kan undersökas, medan få kvantitativa uppgifter om mikrocirkulation utveckling.
Härmed presenterar vi ett protokoll som beskriver en ny tillämpning av aorta ring analysen. Mänskliga MSCs var samtidig odlade med utveckla råtta-derived aorta endothelial nätverk för att bedöma deras bidrag som rör bildande, mognad och homeostas. Denna version av aorta ring analysen bedömer förmågan och styrkan av cell terapi kandidater till hem till platser av angiogenes, utföra medla ECM bearbetning och bidra till endotel tubulär utveckling genom att etablera pericyt-liknande fysiska interaktioner. Förutom att kvantifiera nettoeffekten av MSCs på in vitro- endothelial nätverk bildas och observera intercellulära interaktioner, optimerad vi också ett protokoll för att isolera MSCs från samtidig kulturer. Genom att utföra flödescytometri och qPCR, är det möjligt att karaktärisera förändringar i MSC fenotyp och gen uttryck efter samtidig kultur. Som modell celltyper, Vi jämförde ontogenetically tidigt (prenatal) och sena (vuxen) källor till mänskliga MSCs: FTM HUCPVCs och mänsklig benmärg-derived MSCs (BMSC), respektive i aorta ring-analysen. Vi föreslår att aorta ring analysen kan användas till studerar angiogena potential någon fysiskt stödjande celltyp när under utredning för angiogena regenerativ applikationer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns flera kritiska skeden i ställa in en framgångsrik aorta ring assay MSC samtidig kultur experiment. Först, de viktigaste stegen när isolera och snittning aorta är: 1) erhålla uteslutande bröstkorg segmentet av aorta; (2) noggrant bort förgrenade blodkärl, bindväv och fettväv och; (3) skära även sektioner av aorta (~ 1 mm) att begränsa variabiliteten mellan varje försök. Andra, den framgångsrika inbäddning av aorta ringar i BME är kritiska för denna analys. Om BME är inte fullständigt polyme…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar följande anställda och forskning personal: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai och Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
