Aort yüzük ortak kültür tahlil: Mezenkimal Stromal hücre Vitro anjiogenik potansiyelini değerlendirmek için uygun bir araç
Summary
Burada, prelabelled Mezenkimal hücrelerin sıçan aort kaynaklı endotel ağları ile birlikte kültürlü nerede aort yüzük testin yeni bir uygulama mevcut. Bu roman yöntemi görselleştirme Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) posta ve endotel ağları ile entegrasyon, miktar ağ özellikleri ve MSC immunophenotypes ve gen ifade değerlendirme sağlar.
Abstract
Anjiogenez bir karmaşık, yüksek düzenlenmiş sağlayan ve yeterli doku perfüzyon sürdürmek sorumlu işlemidir. Aşırı bol vasküler geliştirme kanser ve enflamatuar bozuklukları ile ilişkili olmakla birlikte yetersiz damarlara bakım ve patolojik malformasyonlar ağır iskemik hastalıklar, neden olabilir. Pro-anjiogenik tedavi bir umut verici yeni damarlara geliştirmek için düzenleyici faktörler de fiziksel destek sağlayabilir anjiogenik hücre kaynaklarının biçimidir.
Mezenkimal Stromal hücre (MSCs) algılamak ve iskemik veya iltihaplı dokulara ev için kapsamlı bir şekilde incelenen parakrin etkileri ve yeteneklerini nedeniyle damar rejenerasyon adaylarıdır. Özellikle ilk üç aylık dönem insan göbek kordonu Perivasküler (FTM HUCPVCs) onların pericyte gibi özellikler, proliferatif ve multilineage potansiyeli yüksek, bağışıklık ayrıcalıklı özellikler ve sağlam parakrin nedeniyle son derece gelecek vaat eden bir aday hücrelerdir profil. Etkili bir şekilde potansiyel anjiogenik rejeneratif hücre değerlendirmek için onlara güvenilir ve “çevrilebilir” önceden klinik deneyleri test için gerekli olduğunu. Aort yüzük tahlil endotel yapılar kolay miktar için sağlar, Aksesuar destekleyici hücreleri ve hücre dışı Matriks (ECM) ana bilgisayardan sağlayan, inflamatuar bileşenleri hariç, ve bir ex vivo angiogenez modelidir hızlı ve ucuz ayarlamak. Bu zaman içinde vivo modelleri (örneğin, kornea tahlil, Matrigel tak tahlil); göre avantajlıdır Aort yüzük tahlil yönetilen hücreleri izleyebilir ve hücreler arası etkileşimler xeno-bağışıklık ret kaçınırken gözlemlemek.
Biz gelişmekte olan fare aort endotel ağları ile ortak kültürde insan MSCs içerir aort yüzük testin roman bir uygulama için bir iletişim kuralı mevcut. Bu tahlil analiz oluşumu ve gelişimi fiziksel pericyte gibi etkileşimleri aracılığıyla tüp için MSC katkı ve onların potens aktif angiogenez sitelere geçirmek için ve yeteneklerini gerçekleştirmek ve arabuluculuk değerlendirmek için izin verir ECM işleme. Bu iletişim kuralı MSC fenotip ve gen ifade ortak kültür aşağıdaki değişiklikler üzerinde daha fazla bilgi sağlar.
Introduction
Karmaşık süreç angiogenez geliştirir ve damarlara1önceden varolan yeni kan damarı geliştirme teşvik ederek doku perfüzyon korur. Pro-anjiogenik ve anti-anjiogenik faktörler tarafından sıkı bir şekilde düzenlenmiş, dengeli bir süreçtir. Bu sistemde herhangi bir eksikliği, yetersiz gemi bakım ya da büyüme, miyokardiyal hastalığı, inme ve nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere ağır iskemik hastalıklar neden neden olabilir. Ancak, abartılı vasküler geliştirme kanser ve enflamatuar bozuklukları2dahil olmak üzere koşullar özelliğidir.
Olumlu doku rejenerasyonu ulaşmak için anjiogenezi kontrol hedefliyoruz tedaviler geliştirmek anahtar öneme sahiptir. Geniş preklinik ve klinik araştırmalar rağmen istenilen sonuçları3,4,5ulaşmak pro-anjiogenik faktörler ve mikroRNA’lar kullanarak angiogenez uyarmak için girişimleri başarısız. Geçici efektler için olası nedenler şunlardır: anjiogenik proteinler ve nükleik asitleri ve sınırlı sayıda sınırlı uzun ömürlü hedeflenen büyüme faktörleri6,7. Çözünür anjiogenik faktörler angiogenez başlatmak için gerekli olmakla birlikte, bakım ve damarlara işlevselliğini perisitlerden ve düz kas hücreleri8de dahil olmak üzere hücre tipleri destekleyen bağlıdır. Pro-anjiogenik tedavi alan artık fiziksel olarak destekleyen yeni geliştirilen damarlara, kendini sürekli yenileyen veya içine bile ayırt ederken anjiogenik faktörler yerel olarak sağlayabilir potansiyel kök hücre ve progenitör hücre kaynakları keşfetmek endotel benzeri hücreler9,10. Hücre tipleri bu fonksiyonel gereksinimleri yerine getirmek için yeteneği ile en uygun anjiogenik bulma iskemik doku rejenerasyonu için büyük söz sahibidir.
Başarılı bir şekilde potansiyel hücre tabanlı terapiler klinik çevirmek için önceden klinik çalışmalar onların etkinliğini göstermek ve temel anjiogenik mekanizmaları vurgulamak gerekir. Kurulan angiogenez deneyleri yüksek sayıda rağmen alan güvenilir bir şekilde potansiyel aday hücre türleri11,12, etkinliğini değerlendirmek olabilir bir “altın standart” vitro tahlil yoksun 13. (endotel proliferasyon, geçiş ve tüp oluşumu deneyleri de dahil olmak üzere) çoğu vitro angiogenez deneyleri genellikle endotel hücre phenotypical değişiklikler veya içine farklılaşma hücre veya bileşikler etkilerini değerlendirmek borulu ve ağ yapıları14,15. Bu özellikler angiogenez için kritik olmakla birlikte, bir “çevrilebilir” tahlil da değerlendirmelidir: 1) büyütme veya yenisi ile değiştirme perisitlerden veya düz kas hücreleri, ECM ve/veya membran, 2) işlenmesi de dahil olmak üzere destek hücre tiplerinin ve 3). fonksiyonel microvasculature oluşumu tanıtmak için verimlilik. Vivo angiogenez modeller, kornea tahlil ve Matrigel tak tahlil, benzersiz vivo içinde microenvironment özetlemek ama yönetilen izleme hücre zorluk fiziksel etkileşim gözlemlemek için zorlanmaktadır. Ayrıca, in vivo modellerinde, potansiyel allojeneik hücre terapisi aday16test ederken xeno-bağışıklık ret oluşabilir. Ex vivo angiogenez modelleri, özellikle aort yüzük tahlil sağlayabilir: 1) kolay gözlem ve miktar ECM 3) 4) dışlama inflamatuar ana bilgisayar ve yapay malzemeleri, tübüler yapıların, 2) Aksesuar destekleyici hücreleri, bileşenler ve 5) hızlı ve ucuz17,18. Genellikle, aort yüzük tahlil küçük salgı proteinler, farmakolojik ve transgenik kemirgen modelleri19,20,21anjiogenik potansiyelinin test edebilirsiniz.
MSCs öncelikle den onların etkileri parakrin aracılı22,23,24vasküler rejenerasyon için umut verici adaylardır. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), hepatosit büyüme faktörü (HGF), dahil olmak üzere anahtar anjiogenik faktör salgılaması için MSCs gösterilmiştir İnsülin benzeri büyüme faktörü-1 (IGF-1), temel Fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve angiopoeitin-1 (Ang-1)25 ,26. MSCs da algılayabilir ve ev sahipliği iskemik veya iltihaplı doku, ancak, tam mekanizmalar hâlâ soruşturuluyor. Giderek, edebiyat çoğu MSCs Perivasküler hücrelerden ortaya, pericyte işaretleri co hızlı ve perisitlerden27gibi davranabilir hipotezi destekler. HUCPVCs insan göbek kordonu Perivasküler bölgesinden elde edilen MSCs genç bir kaynaktır. Onlar MSCs nüfusu pericyte benzeri özellikleri ile temsil ve FTM ve terimi göbek bağları ile karakterizedir. FTM HUCPVCs yüksek bir ifade CD146 ve NG2, proliferatif ve multilineage potansiyeli yüksek, bağışıklık ayrıcalıklı özellikler de dahil olmak üzere pericyte işaretlerinin göstermek ve bir sağlam parakrin profil28görüntüler. FTM HUCPVCs yaralı doku pericyte benzeri özellikleri ile yeni damarlara teşviki ile rejenerasyon teşvik için ideal bir aday hücre tipi vardır.
Anjiogenik potansiyeli ve insan MSCs pericyte gibi özelliklerini sınamak için anjiogenez deneyleri çok sınırlı sayıda mevcut olumlu nerede angiotropic geçiş (bundan sonra “posta” olarak anılacaktır), işleme ECM ve fiziksel gelişimi vardır hücre tipleri arasındaki etkileşimler, microvasculature gelişimi üzerine Nicel veri alırken soruşturma.
Bu vesile ile aort yüzük testin yeni bir uygulamayı açıklayan bir iletişim kuralı mevcut. İnsan MSCs oluşumu, olgunlaşma ve homeostasis tüp için yaptıkları katkı değerlendirmek için gelişmekte olan fare kaynaklı aort endotel ağları ile birlikte kültürlü. Aort yüzük tahlil bu sürümü yetenek ve kudret eve angiogenez sitelere gerçekleştirmek ve ECM işleme aracılık ve pericyte gibi fiziksel kurulması ile endotel borulu gelişmeye katkıda hücre terapisi adayların değerlendiriyor etkileşimler. MSCs net etkisi vitro endotel ağ oluşumu üzerinde miktarının ve hücreler arası etkileşimler gözlemleyerek ek olarak, biz de ortak kültürler MSCs yalıtmak için bir protokol optimize. Akış Sitometresi ve qPCR gerçekleştirerek, MSC fenotip ve gen ifade ortak kültür aşağıdaki değişiklikleri tanımlamak mümkündür. Olarak model hücre tipleri, biz ontogenetically erken göre (doğum öncesi) ve insan MSCs geç (Yetişkin) kaynakları: FTM HUCPVCs ve insan kemik iliği türevi MSCs (BMSC), sırasıyla, aort yüzük tahlil içinde. Önerdiğimiz aort yüzük tahlil soruşturma zaman anjiogenik rejeneratif uygulamaları altında fiziksel olarak destekleyen herhangi bir hücre tipi anjiogenik potansiyelinin çalışma için kullanılabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bir başarılı aort yüzük tahlil MSC ortak kültür deney ortamında birkaç kritik aşama vardır. İlk olarak, yalıtma ve aort kesit en önemli adımlar şunlardır: 1) aort; sadece torasik segment elde etme 2) dikkatle dallanma kan damarları, bağ ve yağ dokusu kaldırma ve; 3) kesme bile bölümleri her tahlil arasında değişkenlik sınırlamak için aort (~ 1 mm). İkinci olarak, başarılı aort halkaları BME gömme bu tahlil için önemlidir. BME tamamen polimerli ya da düzensiz polimerli BME içinde gö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar aşağıdaki personel üye teşekkür ve araştırma personeli: Andrée Gauthier-Fisher, Matthew Librach, Tanya Barretto, Tharsan Velauthapillai ve Sarah Laronde.
Materials
| Alpha-MEM | Gibco | 12571071 | For FTM HUCPVC and BMSC culture media. |
| APC-conjugated anti human TRA-1-85 | R&D Systems | FAB3195A | Human-specific cell marker for flow cytometry and cell sorting |
| Basal membrane extract (BME) (Matrigel) | Corning | 354234 | For aorta embedding |
| Bullet-kit | Lonza | CC-3162 | Includes: Gentamicin/Amphotericin-B (GA)human Epidermal Growth Factor (hEGF); Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF); R3- Insulin-like Growth Factor-1 (R3-IGF-1); Ascorbic Acid; Hydrocortisone; human Fibroblast Growth Factor-Beta (hFGF-β); Heparin; Fetal Bovine Serum (FBS). Required to prepare EGM |
| CellTracker Green CMFDA Dye | Thermo-fisher | C2925 | For staining MSCs, green is picked up optimally by MSCs |
| CKX53 Culture Microscope | Olympus | For bright-field imaging of endothelial network development | |
| Countess automated cell counter | Invitrogen | C10227 | Cell counting for MSC culture, flow cytometry and qPCR |
| Dispase | StemCell technologies | 7923 | For dissociating aortic ring-MSC co-cultures (pre-warm at 37 °C) |
| Disposable sterile scalpels | VWR | 21909-654 | For sectioning aorta |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | D8537 | PBS. 1X, Without calcium chloride and magnesium chloride |
| Endothelial basal media (EBM) | Lonza | CC-3156 | Basal media required for culturing aortic ring assay-MSC co-cultures (warm at 37 °C before use). Required for EGM and EBM-FBS |
| Ethanol, 70%, Biotechnology Grade | VWR | 97064-768 | To sterilize surfaces |
| EVOS | Life Technologies | In-house fluorescent microscope to track MSC migration and integration | |
| Fetal bovine serum (FBS) (Hyclone) | GE Healthcare | SH3039603 | Serum component of cell culture medium |
| FITC-conjugated anti-CD31 antibody | BD | 558068 | Human endothelial marker for flow cytometry |
| FITC-conjugated anti-CD146antibody | BD | 560846 | Human pericyte marker for flow cytometry |
| Forceps | Almedic | 7727-A10-704 | For handing rat tissue. Can use any similar forceps |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Life Technologies | 14175-094 | 1X Without calcium chloride and magnesium chloride |
| HERAcell 150i CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | 51026410 | For incubating cells |
| Human Angiogenesis RT2 profiler PCR array | Qiagen | PAHS-024Z | Human specific and includes primers for 84 genes involved in angiogenesis. Each well is 1 primer reaction |
| ImageJ | Open source image processing software. Require Angiogenesis analyzer plugin | ||
| LSR II | BD | UHN SickKids FC Facility. For flow cytometry. | |
| MoFlo Astrios | Beckman Coulter | UHN SickKids FC Facility. For cell sorting. | |
| Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140122 | Antibiotic component to buffers and cell culture medium |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA purification. Includes cell lysis buffer |
| RT2Easy First Strand Kit | Qiagen | 330421 | For preparation of cDNA for qPCR |
| RT2PreAMP cDNA Synthesis Kit | Qiagen | 330451 | Pre-amplification of cDNA if low-yield RNA |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | For cutting skin, muscle and aorta |
| Sterile gauze | VWR | 3084 | To dampen and sterilize chest fur |
| TrypleE | Thermo Fisher Scientific | 12605036 | MSC dissociation enzyme pre-warm at 37 °C |
| 0.2 μm pore filtration unit | Thermo Fisher Scientific | 566-0020 | To sterilize tissue culture media |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200056 | For cell dissociation, pre-warm at 37 °C |
| 10 cm tissue culture dishes | Corning | 25382-428 | For cleaning and sectioning aorta and MSC cell culture |
| 12 well-cell culture plates | Corning-Sigma Aldrich | CLS3513 | For setting up aortic ring assay-MSC co-cultures |
| 15 mL tube | BD Falcon | 352096 | For general tissue culture procedures |
| 70 μm cell strainer | Fisherbrand | 22363548 | To ensure a single cell suspension before flow cytometry or sorting |
References
- Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
- Hoeben, A., Landuyt, B., Highley, M. S., Wildiers, H., Van Oosterom, A. T., De Bruijn, E. A. Vascular endothelial growth factor and angiogenesis. Pharmacol Rev. 56 (4), 549-580 (2004).
- Khan, T. A., Sellke, F. W., Laham, R. J. Gene therapy progress and prospects: therapeutic angiogenesis for limb and myocardial ischemia. Gene Ther. 10 (4), 285-291 (2003).
- Gupta, R., Tongers, J., Losordo, D. W. Human studies of angiogenic gene therapy. Circ Res. 105 (8), 724-736 (2009).
- Chu, H., Wang, Y. Therapeutic angiogenesis: controlled delivery of angiogenic factors. Ther Deliv. 3 (6), 693-714 (2012).
- Cao, Y. Therapeutic angiogenesis for ischemic disorders: what is missing for clinical benefits?. Discov Med. 9 (46), 179-184 (2010).
- Said, S. S., Pickering, J. G., Mequanint, K. Advances in growth factor delivery for therapeutic angiogenesis. J Vasc Res. 50 (1), 35-35 (2013).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro Oncol. 7 (4), 452-464 (2005).
- Leeper, N. J., Hunter, A. L., Cooke, J. P. Stem cell therapy for vascular regeneration: adult, embryonic, and induced pluripotent stem cells. Circulation. 122 (5), 517-526 (2010).
- Sieveking, D. P., Ng, M. K. Cell therapies for therapeutic angiogenesis: back to the bench. Vasc Med. 14 (2), 153-166 (2009).
- Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. Int J Exp Pathol. 90 (3), 195-221 (2009).
- Auerbach, R., Lewis, R., Shinners, B., Kubai, L., Akhtar, N. Angiogenesis assays: a critical overview. Clin Chem. 49 (1), 32-40 (2003).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Benton, G. The endothelial cell tube formation assay on basement membrane turns 20: state of the science and the art. Angiogenesis. 12 (3), 267-274 (2009).
- Arnaoutova, I., Kleinman, H. K. In vitro angiogenesis: endothelial cell tube formation on gelled basement membrane extract. Nat Protoc. 5 (4), 628-635 (2010).
- Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10 (3), 588-612 (2006).
- Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. J Cell Mol Med. 13 (10), 4113-4136 (2009).
- Baker, M., et al. Use of the mouse aortic ring assay to study angiogenesis. Nat Protoc. 7 (1), 89-104 (2011).
- Guo, J., et al. A secreted protein (Canopy 2, CNPY2) enhances angiogenesis and promotes smooth muscle cell migration and proliferation. Cardiovasc Res. 105 (3), 383-393 (2015).
- Wittig, C., Scheuer, C., Parakenings, J., Menger, M. D., Laschke, M. W. Geraniol Suppresses Angiogenesis by Downregulating Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)/VEGFR-2 Signaling. PLoS One. 10 (7), e0131946 (2015).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biol Proced Online. 4, 24-31 (2002).
- Caplan, A. I. Adult mesenchymal stem cells for tissue engineering versus regenerative medicine. J Cell Physiol. 213 (2), 341-347 (2007).
- Caplan, A. I., Dennis, J. E. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem. 98 (5), 1076-1084 (2006).
- Keating, A. Mesenchymal stromal cells: new directions. Cell Stem Cell. 10 (6), 709-716 (2012).
- Kilroy, G. E., et al. Cytokine profile of human adipose-derived stem cells: expression of angiogenic, hematopoietic, and pro-inflammatory factors. J Cell Physiol. 212 (3), 702-709 (2007).
- Tang, Y. L., et al. Paracrine action enhances the effects of autologous mesenchymal stem cell transplantation on vascular regeneration in rat model of myocardial infarction. Ann Thorac Surg. 80 (1), 229-236 (2005).
- Caplan, A. I. All MSCs are pericytes?. Cell Stem Cell. 3 (3), 229-230 (2008).
- Hong, S. H., et al. Ontogeny of human umbilical cord perivascular cells: molecular and fate potential changes during gestation. Stem Cells Dev. 22 (17), 2425-2439 (2013).
- Kilkenny, C., Browne, W. J., Cuthill, I. C., Emerson, M., Altman, D. G. Improving bioscience research reporting: The ARRIVE guidelines for reporting animal research. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 94-99 (2010).
- Sarugaser, R., Ennis, J., Stanford, W. L., Davies, J. E. Isolation, propagation, and characterization of human umbilical cord perivascular cells (HUCPVCs). Methods Mol Biol. 482, 269-279 (2009).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Gelati, M., Aplin, A. C., Fogel, E., Smith, K. D., Nicosia, R. F. The angiogenic response of the aorta to injury and inflammatory cytokines requires macrophages. J Immunol. 181 (8), 5711-5719 (2008).
