Techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen voor inductie van links ventriculaire hypertrofie
Summary
Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap de techniek van minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing (TAC) in muizen. Door eliminatie van intubatie en ventilatie die verplicht is voor de gebruikte standaardprocedure zijn, minimaal invasieve TAC vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten.
Abstract
Transversale aorta vernauwing (TAC) in muizen is een van de meest gebruikte chirurgische technieken voor experimentele onderzoek van druk overbelasting-geïnduceerde ventriculaire hypertrofie (LVH) en de progressie van links naar hartfalen. Deze procedure is in het merendeel van de gerapporteerde onderzoeken uitgevoerd met intubatie en ventilatie van het dier dat maakt het veeleisende en tijdrovende en draagt bij aan de chirurgische lasten aan het dier. Het doel van dit protocol is voor het beschrijven van een vereenvoudigde methode van minimaal invasieve TAC zonder intubatie en ventilatie van muizen. Kritische stappen van de techniek worden benadrukt met het oog op lage sterfte en hoog rendement in inducerende LVH.
Mannelijke C57BL/6 muizen (10-week-oude, 25 à 30 g, n = 60) werden verdoofd met een enkele intraperitoneale injectie van een mengsel van ketamine en xylazine. In een spontaan ademhaling dier na een 3-4 mm bovenste gedeeltelijke sternotomy, een segment van 6/0 zijde hechtdraad schroefdraad door het oog van een afbinding steun werd aangenomen onder de aortaboog en gebonden over een afgestompte 27-gauge naald. Sham bediende dieren onderging de dezelfde chirurgische voorbereiding maar zonder vernauwing van de aorta. De doeltreffendheid van de procedure in het inducerende LVH wordt getuigd door een aanzienlijke toename van het hart/lichaam / gewichtsverhouding. Deze verhouding wordt verkregen dagen 3, 7, 14 en 28 na chirurgie (n = 6-10 in elke groep en elk tijdstip). Met behulp van onze techniek wordt LVH waargenomen in TAC t.o.v. sham dieren vanaf dag 7 tot dag 28. Operatieve en late (meer dan 28 dagen) sterfte zijn beide zeer laag op 1,7%.
Kortom, onze kosteneffectieve techniek van minimaal invasieve TAC in muizen draagt zeer lage operatieve en post-operatieve sterfte en is zeer efficiënt in het inducerende LVH. Het vereenvoudigt de operatieve procedure en vermindert de stam het dier op te zetten. Het kan gemakkelijk worden uitgevoerd door de kritische stappen in dit protocol.
Introduction
In het afgelopen jaar, de studie van hartfalen is uitgevoerd in levensvatbare diermodellen1. Vergeleken met grote dierlijke modellen van hartverlamming, hebben kleine dierlijke modellen talrijke potentiële voordelen. Naast lagere kosten van huisvesting en onderhoud zijn kleine dierlijke modellen toegankelijk voor meer onderzoekers als gevolg van de minder complex faciliteiten die nodig zijn2.
Hartfalen Muismodellen biedt veel van dezelfde voordelen als de rat-modellen. Bovendien tot verminderde huisvesting kost3, Muismodellen profiteren van de beschikbaarheid van relevante transgene en knockoutstadia (KO) stammen. De mogelijkheid van cel type-specifieke, afleidbare KO of transgene strategieën maken de muis een waardevol instrument te bestuderen van de pathogenese van hartfalen en te proberen vast te stellen nieuwe therapeutische regimes3.
Onder de muis modellen van hartfalen gebruikt momenteel4, dwarse aorta vernauwing (TAC) die voor het eerst door Rockman5 beschreven werd is het aangewezen model voor het genereren van druk overbelasting-geïnduceerde links ventriculaire hypertrofie (LVH)1 , 3. het grootste voordeel van dit model is de mogelijkheid tot stratificatie van LVH2, hoewel links ventriculaire remodelleren in reactie op TAC is variabel tussen verschillende muis stammen. In het bijzonder, ontwikkelen C57BL/6 muizen snelle LV dilatatie na TAC, die niet met andere stammen4,6,7kan optreden.
Het plotselinge begin van hypertensie bereikt met TAC oorzaken een ongeveer 50% toename in LV massa binnen 2 weken, waardoor snel onderzoeken de activiteit van farmacologische of moleculaire interventies die gericht zijn op de ontwikkeling van LVH4modulerende. De acute inductie van ernstige hypertensie door TAC niet precies het reproduceren van de progressieve links ventriculaire hypertrofie en remodelleren waargenomen in de klinische setting van aorta stenose of arteriële hypertensie. Dit model wordt echter gebruikt door veel onderzoekers te identificeren en aanpassen van nieuwe therapeutische doelen in hartfalen4.
Uitvoeren van TAC in muizen vereist meer chirurgische expertise die nodig is voor andere technieken die worden gebruikt voor het opwekken van LVH en latere hartfalen2. De meeste auteurs uitvoeren deze procedure door intubating en ventileren van de dierlijke2,8, waardoor deze procedure meer veeleisende en tijdrovende en wordt toegevoegd aan de chirurgische lasten voor het dier. Alleen enkele onderzoekers hebben minimaal invasieve TAC gebruikt in hun studie met korte verwijzing naar de chirurgische ingreep9,10,11.
Het doel van dit protocol is te beschrijven stap voor stap een vereenvoudigde en gebruikersvriendelijke techniek van minimaal invasieve dwarse vernauwing van de aorta in muizen, markeren de kritieke fasen van de procedure. Door de volgende belangrijke stappen, kunt een gemakkelijk deze techniek uitvoeren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het doel van dit protocol is te presenteren van een stap voor stap illustratie van de chirurgische techniek voor minimaal invasieve dwarse aorta vernauwing in muizen. Gedetailleerde technische beschrijving van transversale aorta vernauwing in muizen is gemeld door andere auteurs2,8. Echter, deze onderzoekers chirurgie uitvoeren na intubatie en ventilatie van dieren. Het gebruik van een extra stap van intubatie-ventilatie vergroot de complexiteit en de duur van de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een subsidie (N ° 32016) van de Zwitserse cardiovasculaire Stichting RT.
Materials
| Surgical microscope | Olympus | SZX2-TR30 | |
| Razor | Rowenta | Nomad TN3650FO | |
| Sutures: | |||
| Polypropylene 7/0 | Ethicon | BV-1X | |
| Polypropylene 6/0 | BBraun | C0862061 | |
| Silk 6/0 ligature | FST | 18020-60 | |
| Polypropylene 4/0 | Ethicon | 8683 | |
| Polypropylene 5/0 | Ethicon | Z303 | |
| Drugs: | |||
| Ketamin | Merial | Imalgène 1000, LBM154AD | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2%, KP09PPC | |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic, 072013 | |
| Instruments: | |||
| Bone nippers | Fine Surgical Tools | 16101-10 | |
| Ligation aid | Fine Surgical Tools | 18062-12 | |
| Tying forceps | Fine Surgical Tools | 18026-10 | |
| Needle holder Crile-Wood | Fine Surgical Tools | 12003-15 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11003-12 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Tissue forceps | Fine Surgical Tools | 11021-12 | |
| Microsurgery needle holder | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Microsurgery scissors | Fine Surgical Tools | 91501-09 | |
| Mayo scissors | Fine Surgical Tools | 14511-15 | |
| 11-blade knife | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| RNA extraction and qPCR: | |||
| TriReagent | Euromedex | TR-118-200 | |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74704 | |
| Qubit Fluorimetric RNA assay | Fisher Scientific | 10034622 | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| High Capacity cDNA kit | Fisher Scientific | 10400745 | |
| Taqman Master Mix | Fisher Scientific | 10157154 | |
| Taqman BNP primers | Fisher Scientific | Mm01255770_g1 | |
| Taqman ANP primers | Fisher Scientific | Mm01255747_g1 | |
| Taqman ACE primers | Fisher Scientific | Mm00802048_m1 | |
| Taqman Col1a1 primers | Fisher Scientific | Mm00801666_g1 | |
| Taqman TGFb primers | Fisher Scientific | Mm01178820_m1 | |
| Taqman Gapdh primers | Fisher Scientific | Mm99999915_g1 | |
| ABIPrism Thermocycler | Applied Biosystems | 7000 | |
| Software: | |||
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism 7 | |
| Animal food | |||
| Complete diet for adult rats/mice | Safe | UB220610R |
References
- Molinari, F., Malara, N., Mollace, V., Rosano, G., Ferraro, E. Animal models of cardiac cachexia. Int. J. Cardiol. 219 (15), 105-110 (2016).
- Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods. Mol. Biol. 573, 115-137 (2009).
- Verma, S. K., Krishnamurthy, P., Kishore, R., Ardehali, H., et al. Transverse aortic constriction: a model to study heart failure in small animals. Manual of Research Techniques in Cardiovascular Medicine. , 164-169 (2014).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure. Development of novel therapies, past and present. Circ. Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292 (5), 2119-2130 (2007).
- Deschepper, C. F., Olson, J. L., Otis, M., Gallo-Payet, N. Characterization of blood pressure and morphological traits in cardiovascular-related organs in 13 different inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 97 (1), 369-376 (2004).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. Transverse aortic constriction in mice. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Hu, P., Zhang, D., Swenson, L., Chakrabarti, G., Abel, E. D., Litwin, S. E. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor ϒ coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (2), 492-500 (2011).
- Andersen, N. M., Tang, R., Li, L., Javan, H., Zhang, X. Q., Selzman, C. H. IKK-β inhibition prevents adaptive left ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 178 (1), 105-109 (2012).
- Nemska, S., Monassier, L., Gassmann, M., Frossard, N., Tavakoli, R. Kinetic mRNA profiling in a rat model of left ventricular hypertrophy reveals early expression of chemokines and their receptors. PLoS ONE. 11 (8), 0161273 (2016).
- Liao, Y., et al. Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (5), 1703-1708 (2002).
- Stansfield, W. E., et al. Characterization of a model to independently study regression of ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 142 (2), 387-393 (2007).
- Beetz, N., et al. Ablation of biglycan attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis after left ventricular pressure overload. J. Mol. Cell. Cardiol. 101, 145-155 (2016).
