Técnica de constrição da aorta minimamente invasiva transversal em camundongos para indução de Hipertrofia Ventricular Esquerda
Summary
O objectivo do presente protocolo é descrever passo a passo a técnica de constrição da aorta transversa minimamente invasiva (TAC) em camundongos. Pela eliminação de intubação e ventilação que são obrigatórios para o procedimento padrão comumente usado, TAC minimamente invasiva simplifica o procedimento operatório e reduz o esforço de colocar o animal.
Abstract
Constrição da aorta transversa (TAC) em camundongos é dentre as técnicas cirúrgicas mais utilizadas para a investigação experimental de pressão induzida por sobrecarga esquerda hipertrofia ventricular (HVE) e sua progressão para insuficiência cardíaca. Na maioria dos inquéritos relatados, este procedimento é realizado com intubação e ventilação do animal que torna exigente e demorado e contribui para a carga cirúrgica para o animal. O objectivo do presente protocolo é descrever uma técnica simplificada de TAC minimamente invasiva sem intubação e ventilação dos ratos. Passos críticos da técnica são enfatizados para atingir baixa mortalidade e alta eficiência na indução de hve.
Camundongos C57BL/6 do sexo masculino (10 semanas, 25-30 g, n = 60) foram anestesiados com uma única injeção intraperitoneal de uma mistura de ketamina e xilazina. Em um respirar espontaneamente animais seguindo uma esternotomia parcial superior de 3 a 4 mm, um segmento de 6/0 de sutura seda enfiada através do olho de uma ajuda de ligadura foi aprovado sob o arco aórtico e amarrado com uma agulha de calibre 27 embotada. Animais com operação submeteu-se a mesma preparação cirúrgica mas sem constrição da aorta. A eficácia do procedimento na indução de hve é atestada por um aumento significativo na proporção de peso de corpo/coração. Esta proporção é obtida no dias 3, 7, 14 e 28 após a cirurgia (n = 6-10 em cada grupo e cada ponto de tempo). Usando a nossa técnica, hve é observada em TAC comparado com animais, farsa do dia 7 até dia 28. Operativa e tardia (mais de 28 dias) mortalidades são ambos muito baixa em 1,7%.
Em conclusão, nossa técnica econômica de TAC minimamente invasiva em camundongos carrega muito baixa mortalidade operatória e pós-operatório e é altamente eficiente na indução de hve. Simplifica o procedimento operatório e reduz o esforço de colocar o animal. Pode ser facilmente realizada seguindo os passos críticos descritos neste protocolo.
Introduction
Nos últimos anos, o estudo de insuficiência cardíaca tem sido conduzido em animal viável modelos1. Comparado a grandes modelos animais de insuficiência cardíaca, pequenos modelos animais tem inúmeras vantagens potenciais. Além de reduzir os custos de habitação e manutenção modelos animais pequenos são acessíveis aos investigadores mais devido a menos complexas instalações necessárias2.
Modelos de mouse insuficiência cardíaca oferecem muitas das mesmas vantagens que os modelos do rato. Além disso, reduzida a carcaça custa3, modelos do rato beneficiam a disponibilidade de relevantes transgénicas e nocaute (KO) cepas. A possibilidade de célula tipo específico, inducible KO ou transgénicas estratégias fazer o mouse uma ferramenta valiosa para estudar a patogênese da insuficiência cardíaca e para tentar identificar novos regimes terapêuticos3.
Entre o mouse modelos de insuficiência cardíaca, atualmente usado4, constrição transversal da aorta (TAC), que foi primeiramente descrita por Rockman5 é o modelo preferido para gerar pressão induzida por sobrecarga esquerda hipertrofia ventricular (HVE)1 , 3. a maior vantagem desse modelo é a capacidade de permitir a estratificação de hve2, embora ventricular esquerda em resposta ao TAC que remodela é variável entre cepas de mouse diferente. Em particular, camundongos C57BL/6 desenvolvem rápida dilatação LV após TAC que não pode ocorrer com outras estirpes4,6,7.
O início súbito de hipertensão alcançado com TAC causas um aproximadamente 50% aumento na massa de LV dentro de 2 semanas, permitindo examinar rapidamente a atividade das intervenções farmacológicas ou moleculares, visando o desenvolvimento de hve4de modulação. A indução aguda de hipertensão grave por TAC não exatamente reproduzir a progressiva hipertrofia ventricular esquerda e remodelação observados na prática clínica de estenose aórtica ou hipertensão arterial. No entanto, este modelo é usado por muitos pesquisadores para identificar e modificar novos alvos terapêuticos em insuficiência cardíaca4.
Executar o TAC em camundongos requer perícia cirúrgica maior do que o necessário para outras técnicas usadas para induzir a hve e subsequente insuficiência cardíaca2. A maioria dos autores executam esse procedimento, intubar e ventilar o animal2,8, o que torna este procedimento mais exigente e demorado e contribui para a carga cirúrgica para o animal. Apenas alguns investigadores utilizaram TAC minimamente invasiva em seu estudo com uma breve referência para o procedimento cirúrgico9,10,11.
O objectivo do presente protocolo é descrever passo a passo uma técnica simplificada e user-friendly de minimamente invasiva constrição da aorta transversa em camundongos, destacando as fases críticas do processo. Seguindo estas etapas principais, um pode facilmente realizar esta técnica.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objectivo do presente protocolo é apresentar uma ilustração passo a passo da técnica cirúrgica para constrição da aorta transversa minimamente invasiva em ratos. Descrição técnica pormenorizada da constrição da aorta transversa em ratos tem sido relatada por outros autores2,8. No entanto, estes investigadores realizar cirurgia após intubação e ventilação dos animais. O uso de uma etapa adicional de intubação-ventilação aumenta a complexidad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado por um subsídio (N ° 32016), da Fundação Suíça Cardiovascular para RT
Materials
| Surgical microscope | Olympus | SZX2-TR30 | |
| Razor | Rowenta | Nomad TN3650FO | |
| Sutures: | |||
| Polypropylene 7/0 | Ethicon | BV-1X | |
| Polypropylene 6/0 | BBraun | C0862061 | |
| Silk 6/0 ligature | FST | 18020-60 | |
| Polypropylene 4/0 | Ethicon | 8683 | |
| Polypropylene 5/0 | Ethicon | Z303 | |
| Drugs: | |||
| Ketamin | Merial | Imalgène 1000, LBM154AD | |
| Xylazine | Bayer | Rompun 2%, KP09PPC | |
| Buprenorphine | Ceva | Vetergesic, 072013 | |
| Instruments: | |||
| Bone nippers | Fine Surgical Tools | 16101-10 | |
| Ligation aid | Fine Surgical Tools | 18062-12 | |
| Tying forceps | Fine Surgical Tools | 18026-10 | |
| Needle holder Crile-Wood | Fine Surgical Tools | 12003-15 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11003-12 | |
| Microsurgery forceps | Fine Surgical Tools | 11002-12 | |
| Tissue forceps | Fine Surgical Tools | 11021-12 | |
| Microsurgery needle holder | Fine Surgical Tools | 12076-12 | |
| Microsurgery scissors | Fine Surgical Tools | 91501-09 | |
| Mayo scissors | Fine Surgical Tools | 14511-15 | |
| 11-blade knife | Fine Surgical Tools | 10011-00 | |
| RNA extraction and qPCR: | |||
| TriReagent | Euromedex | TR-118-200 | |
| Rneasy Mini kit | Qiagen | 74704 | |
| Qubit Fluorimetric RNA assay | Fisher Scientific | 10034622 | |
| RNA 6000 Nano kit | Agilent | 5067-1511 | |
| High Capacity cDNA kit | Fisher Scientific | 10400745 | |
| Taqman Master Mix | Fisher Scientific | 10157154 | |
| Taqman BNP primers | Fisher Scientific | Mm01255770_g1 | |
| Taqman ANP primers | Fisher Scientific | Mm01255747_g1 | |
| Taqman ACE primers | Fisher Scientific | Mm00802048_m1 | |
| Taqman Col1a1 primers | Fisher Scientific | Mm00801666_g1 | |
| Taqman TGFb primers | Fisher Scientific | Mm01178820_m1 | |
| Taqman Gapdh primers | Fisher Scientific | Mm99999915_g1 | |
| ABIPrism Thermocycler | Applied Biosystems | 7000 | |
| Software: | |||
| GraphPad Prism | GraphPad | Prism 7 | |
| Animal food | |||
| Complete diet for adult rats/mice | Safe | UB220610R |
References
- Molinari, F., Malara, N., Mollace, V., Rosano, G., Ferraro, E. Animal models of cardiac cachexia. Int. J. Cardiol. 219 (15), 105-110 (2016).
- Tarnavski, O. Mouse surgical models in cardiovascular research. Methods. Mol. Biol. 573, 115-137 (2009).
- Verma, S. K., Krishnamurthy, P., Kishore, R., Ardehali, H., et al. Transverse aortic constriction: a model to study heart failure in small animals. Manual of Research Techniques in Cardiovascular Medicine. , 164-169 (2014).
- Patten, R. D., Hall-Porter, M. R. Small animal models of heart failure. Development of novel therapies, past and present. Circ. Heart Fail. 2 (2), 138-144 (2009).
- Rockman, H. A., et al. Segregation of atrial-specific and inducible expression of an atrial natriuretic factor transgene in an in vivo murine model of cardiac hypertrophy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (18), 8277-8281 (1991).
- Barrick, C. J., Rojas, M., Schoonhoven, R., Smyth, S. S., Threadgill, D. W. Cardiac response to pressure overload in 129S1/SvImJ and C57BL/6J mice: temporal- and background-dependent development of concentric left ventricular hypertrophy. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 292 (5), 2119-2130 (2007).
- Deschepper, C. F., Olson, J. L., Otis, M., Gallo-Payet, N. Characterization of blood pressure and morphological traits in cardiovascular-related organs in 13 different inbred mouse strains. J. Appl. Physiol. 97 (1), 369-376 (2004).
- Almeida, A. C., van Oort, R. J., Wehrens, X. H. T. Transverse aortic constriction in mice. J. Vis. Exp. (38), (2010).
- Hu, P., Zhang, D., Swenson, L., Chakrabarti, G., Abel, E. D., Litwin, S. E. Minimally invasive aortic banding in mice: effects of altered cardiomyocyte insulin signaling during pressure overload. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285 (3), 1261-1269 (2003).
- Faerber, G., et al. Induction of heart failure by minimally invasive aortic constriction in mice: Reduced peroxisome proliferator-activated receptor ϒ coactivator levels and mitochondrial dysfunction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 141 (2), 492-500 (2011).
- Andersen, N. M., Tang, R., Li, L., Javan, H., Zhang, X. Q., Selzman, C. H. IKK-β inhibition prevents adaptive left ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 178 (1), 105-109 (2012).
- Nemska, S., Monassier, L., Gassmann, M., Frossard, N., Tavakoli, R. Kinetic mRNA profiling in a rat model of left ventricular hypertrophy reveals early expression of chemokines and their receptors. PLoS ONE. 11 (8), 0161273 (2016).
- Liao, Y., et al. Echocardiographic assessment of LV hypertrophy and function in aortic-banded mice: necropsy validation. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 282 (5), 1703-1708 (2002).
- Stansfield, W. E., et al. Characterization of a model to independently study regression of ventricular hypertrophy. J. Surg. Res. 142 (2), 387-393 (2007).
- Beetz, N., et al. Ablation of biglycan attenuates cardiac hypertrophy and fibrosis after left ventricular pressure overload. J. Mol. Cell. Cardiol. 101, 145-155 (2016).
