JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

تحسين أسلوب لإنشاء في المختبر حاجز الدم – المخ نموذج استناداً إلى خلايا المخ الخنزيري بطانية

Published: September 24, 2017
doi:
10.3791/56277
, , , , , , ,
1Lundbeck Foundation Research Initiative on Brain Barriers and Drug Delivery, Department of Biomedicine,Aarhus University, 2Institute of Pharmaceutical Science,King’s College London, 3HICoE Centre for Drug Research,Universiti Sains Malaysia

Summary

وهدف البروتوكول تقديم إجراء محسنة لإنشاء في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) نموذجا يستند إلى خلايا المخ الخنزيري الابتدائي غشائي (ببيكس). نموذج يظهر إمكانية تكرار نتائج عالية، ضيق عالية، وهي مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا في اكتشاف الأدوية.

Abstract

والهدف من هذا البروتوكول ويعرض إجراء أمثل لتنقية وزراعة ببيكس و في المختبر حاجز الدم في الدماغ (BBB) وضع نماذج تستند إلى ببيكس في مونو-الثقافة (MC)، مولودية مع مكيفة astrocyte المتوسطة (ACM)، و عدم الاتصال ثقافة المشارك (NCC) مع أستروسيتيس من الخنزير أو الفئران المنشأ. ببيكس كانت معزولة ومثقف من شظايا من الشعيرات الدموية من كورتيسيس الدماغ من الخنازير المحلية 5-6 أشهر من العمر. تم تنقية هذه الأجزاء بعناية بإزالة السحايا والعزلة وتجانس المادة الرمادية، والترشيح، والهضم الأنزيمي، والطرد المركزي. لمواصلة القضاء على الخلايا تلويث، كان مثقف الشظايا الشعرية مع المحتوية على بوروميسين المتوسطة. عند روافد 60-95%، كانت باساجيد ببيكس المتزايد من الشظايا الشعرية لإدراج تصفية نفاذية الأغشية والمنشأة في النماذج. زيادة حاجز ضيق والنمط الظاهري مميزة BBB من ببيكس، تعامل الخلايا مع عوامل التمايز التالي: غشاء بيرمينت 8-CPT-المخيم (مخيم المختصر هنا) والهيدروكورتيزون المانع فوسفوديستريس، رو-20-1724 (RO). الإجراء الذي أجرى خلال فترة من 9-11 يوما، وعند إنشاء نموذج لجنة التنسيق الوطنية، أستروسيتيس كانت مثقف 2-8 أسابيع مقدما. التقيد بالإجراءات الموصوفة في البروتوكول قد سمح بإنشاء طبقات بطانية ذات النفاذية باراسيلولار مقيدة للغاية، ومع لجنة التنسيق الوطنية نموذج عرض ترانسيندوثيليال متوسط مقاومة كهربائية (طير) 1249 ± 80 سم Ω 2، وباراسيلولار نفاذية (فالتطبيق) “إبليس الأصفر” من 0.90 10-6 ± 0.13 10-6 سم-1 ثانية (يعني ± ووزارة شؤون المرأة، n = 55). أظهرت مزيد من التقييم لهذا النمط الظاهري المجلس التعبير الجيد عن كلودين البروتينات هالة ضيق 5، زوي-1، كاتينين p120 البروتين مفرق أوككلودين وأدهيرينس. ويمكن استخدام نموذج عرض لمجموعة من دراسات BBB في الصحة والمرض، ومع نفاذية باراسيلولار الشديدة التقييد، وهذا النموذج مناسبة للدراسات المتعلقة بالنقل والاتجار داخل الخلايا.

Introduction

البنية الخلوية ووظيفة حاجز الدم في الدماغ

في واجهة جهاز الدورة الدموية والمركزي العصبي (CNS)، أعمال BBB كموقع تنظيمية رئيسية للسيطرة على هومووستاتيك المكروية الجهاز العصبي المركزي، هو أمر ضروري لوظيفة مناسبة وحماية للجهاز العصبي. هو موقع BBB خلايا بطانية بطانة التجويف الأوعية الدموية. في الشعيرات الدموية في الدماغ، تشكيل خلايا بطانية تقاطعات ضيق بين الخلايا المعقدة وأنماط التعبير بقوة الاستقطاب من الناقلين تدفق و efflux خاصة ضمان النقل جزيئية محددة للغاية بين الدم و الدماغ 1. العناصر الهيكلية للمجمعات مفرق ضيق تشمل البروتينات من الأسرة أوككلودين وكلاودين، أوككلودينس زونولا (زوي) البروتينات، سينجولين، وترتبط جزيئات الالتصاق هالة (المربيات). 5 كلودين مهم بشكل خاص في تقييد هالة باراسيلولار. التعريفي، والحفاظ على هذا النمط الظاهري غشائي BBB مميزة تنطوي على التفاعلات الديناميكية مع الخلايا المحيطة بها، بما في ذلك بيريسيتيس، أستروسيتيس، والخلايا العصبية والأغشية الطابق السفلي، الذي جنبا إلى جنب مع الدماغ غشائي الخلايا النموذج نيوروفاسكولار وحدة (NVU)2،3. الآليات التي تشارك في هذه التفاعلات لا بعد فهم فهما كاملا، ولكن تشمل تبادل الإشارات الكيميائية بين الخلايا، والذي يسمح بتحوير نفاذية BBB في الأجل القصير والحث على ميزات BBB طويل الأجل4. Astrocytes خاصة معروفة للمساهمة في النمط الظاهري خلية غشائي الدماغ وهي مصدر للعوامل التنظيمية مثل نيوروتروفيك الدبقية مشتقة عامل (يؤثر في مخيم داخل الخلايا)5، عامل النمو تنتجها الخلايا الليفية الأساسية6، الهيدروكورتيزون7، وتحويل عامل النمو بيتا (TGF-β)8. بيد أن تأثير TGF-β، كانت موضع نقاش9.

من في فيفو إلى في المختبر BBB

في فيفو دراسات عن الاستمرار في تقديم معلومات قيمة عن البيولوجيا BBB. ومع ذلك، نماذج الثقافة خلية يمكن تقدم أفكاراً إضافية وتشكل أدوات مفيدة لفهم الجوانب الجزيئية ووظيفية مفصلة من BBB في الصحة والمرض. على الرغم من صعوبة تحقيق كامل في نماذج في المختبر التفاعلات المعقدة بين أنواع الخلايا والمكونة من BBB، كان هناك، منذ أول تنقية خلايا الدماغ بطانية وتطبيق هذه في مونو-الثقافات 10 , 11 , 12، وتنمية واسعة النطاق لتنقية إجراءات وشروط النمو من BBB الخلية نماذج الثقافة، أدى إلى تشابه أكبر للحاجز في فيفو . الخلايا الأولية من أصل القوارض والخنزير والأبقار، وفي خطوط الخلايا مخلدة تستند النماذج BBB استخداماً في المختبر . يحتوي كل نموذج مختلف المزايا والعيوب. لاختيار نموذج والمقارنة، تستخدم علامات التحقق من الصحة مثل التعبير عن الإنزيمات BBB والناقلين والمستقبلات والبروتينات الهيكلية لإنشاء لمحات عامة عن النماذج المتبعة حاليا1.

وهدف البروتوكول

هو إحدى السمات الهامة ل BBB حاجز ضيق وطير عالية، ومع ذلك عدد كبير من النماذج المتاحة لا تعكس جيدا على مستويات في فيفو . إدراج مساهمات التنمية والتحسين من عدة مختبرات، والهدف من هذا البروتوكول تقديم أسلوب لإنشاء نموذج طير عالية في المختبر BBB استناداً إلى ببيكس الأولية في MC مع أو بدون أية سي أم، أو في لجنة التنسيق الوطنية مع الابتدائية أستروسيتيس الفئران أو أصل الخنزير. وتشمل الجهود الرامية إلى القضاء على خلايا تلويث وتحسين تمايز ببيكس في النمط الظاهري BBB الإجراءات التطبيقية وإنشاء نموذج. وقد نتج عن هذا العمل في إنشاء نماذج طير موثوقة وعالية مع باراسيلولار منخفضة النفاذية وحسن التعبير الوظيفية الرئيسية البروتينات هالة ضيقة والناقلين، ومستقبلات. بيد كما astrocytes عاملاً مساهما في النمط الظاهري خلية غشائي الدماغ، تمثل ثلاثة شروط مختلفة للثقافة تعمل مختلف ثلاث خلايا غشائي الدماغ. نموذج NCC مفيدة على وجه الخصوص لإجراء دراسات لبعض الآليات المتخصصة التي تشارك في اكتشاف المخدرات، ودراسات النقل والاتجار بها داخل الخلايا، وكذلك للتحقيق من التفاعلات خلية خلية حيث التعبير القصوى من الميزات BBB فائدة.

أصل وتاريخ البروتوكول

نموذج المجلس الموصوفة هنا يستند أساسا إلى نموذج الخنزيري الذي وضع في “مختبرات وايساي” (لندن) الدكتور لويز مورغان والزملاء، استناداً إلى نجاح سابق الدماغ بقرى خلية بطانية نموذجي13whichis. طريقة إعداد الخلية الأصلي كان ترشيح مرحلتين استخدام النايلون تنسجم للقبض على ميكروفيسيلس، تليها خطوة سوبكولتورينج لتحسين نقاء. في تطوير الأسلوب سابق، قد تحققت الأمثل BBB النمط الظاهري وحاجز ضيق بالنمو في المتوسط المستكملة، بما في ذلك مواد تحتوي على الأسبستوس. وأدلى المزيد من التعديلات على الأسلوب سكينر R. في مختبر البروفيسور أ. فنادق في مانشستر المملكة المتحدة14،15. الأسلوب الذي اعتمدته مختبر أبوت، لندن بوكل، حيث جعلت باتابينديجي من أبسط بكثير للتحضير بتجنب استخدام astrocytes أو مواد تحتوي على الأسبستوس، والقضاء على خلايا تلويث مثل بيريسيتيس مع بوروميسين. وأكدت الورقات الأولى الحفاظ على نموذج MC العديد من الميزات الهامة في فيفو بي بي بي، بما في ذلك تقاطعات ضيق فعالة ونظم النقل الغشاء بوساطة مستقبلات ترانسسيتوسيس16،17 , 18 , 19 , 20-يوسف س. “في وقت لاحق” مرة أخرى اختبار ثقافة المشارك astrocyte ووجد أنها تحسن كبير طير، حيث أن هذا هو البديل المفضل المستخدمة حاليا في مختبر أبوت21. النموذج الآن تم بنجاح نقل إلى نيلسن م. عرض مختبر في آرهوس، حيث تم إجراء المزيد من التعديلات (هذا البروتوكول)، بما في ذلك تبسيط غراي يهم استخراج واستخدام شبكة واحدة فقط خطوة الترشيح، وخطوة طلاء تصفية واحد الجمع بين الكولاجين وفيبرونيكتين. تستند الإجراءات التطبيقية لعزل الخنزير أستروسيتيس (هذا البروتوكول) البروتوكولات الذي وضعه مختبر Moos ت. في البورغ، وصف Thomsen et al22. في طير وخصائص أخرى للنموذج التي تم إنشاؤها في لندن وارهوس مماثلة، مما يعطي الثقة للفكرة القائلة بأن هذا النموذج سهولة نقلها بين مختبرات ويستجيب جيدا لرصد دقيق وترشيد أسلوب الخطوات. في الواقع، أنشأ يوسف س. الآن نموذج MC في البلاد المدارية (ماليزيا)23، التي تنطوي على مزيد من التكيف للظروف المحلية ومصادر الأنسجة.

مزايا أكثر الأساليب البديلة وحاليا إنشاء النماذج

بالمقارنة مع خلايا الدماغ بطانية المنشأ البقري والقوارض، ببيكس توفر ميزة وجود معدل أقل من الخسارة في فيفو BBB النمط الظاهري بعد عزل24. وعلاوة على ذلك، ببيكس قادرون على تشكيل الحواجز غشائي ضيق نسبيا، حتى عندما تزرع في MC (800 Ω سم2)16 مقارنة بالمستويات المبلغ عنها شيوعاً مونولاييرس خطوط الخلايا مثل bEND.5 و bEND.3 (سم Ω 502) 25 , 26 , 27وسند (300-800 Ω سم2)28،،من2930، و31،29،سيريبيند (سم Ω 5002)32والدماغ الأولية خلايا بطانية للماوس (100-300 سم Ω2)[س] = “xref” > 33،34،،من3536 والفئران (100-300 سم Ω2)37،38. بيد أظهرت طير التبعية على إجراءات تنقية والثقافة. في معظم الحالات، يظهر إضافة مواد تحتوي على الأسبستوس أو الثقافة المشتركة مع astrocytes آثار التفريق في خلايا بطانية وزيادة في ضيق من طبقات غشائي1. ومع ذلك، مع الجهود المبذولة لتحسين ظروف تثقيف، فقط النماذج المستندة إلى الأبقار أظهرت القيم طير قابلة للمقارنة للنماذج المستندة إلى الخنزير (متوسطات 800 Ω سم2 في MC، تصل إلى 2500 Ω سم2 في ثقافة المشارك أستروسيتي)13 39، ،،من4042،41،43،،من4445. كنماذج تستند إلى الدماغ البقري الأولية أظهرت خلايا بطانية تفاوتاً كبيرا، بين وداخل المختبرات14،45،46،،من4748، يمكن أن تكون إمكانية تكرار نتائج قضية. في نموذج المجلس ذكرت هنا، حققت المختبرات المساهمة طير مشابهة جداً وقيم النفاذية باراسيلولار مع تقلب منخفض، على حد سواء في وبين المختبرات. ومن ثم، سيكون من الممكن لمختبرات أخرى إلى إقامة نموذج قوي مع تقلب منخفضة باستخدام الطريقة المعروضة هنا. بالإضافة إلى تكوين طبقات غشائي ضيق، سبق صحة النماذج مع ببيكس بالتعبير عن البروتينات مفرق ضيق ووظيفية BBB الناقلين والمستقبلات والأنزيمات وأظهرت مدى ملاءمتها لمجموعة من الدراسات15 , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59-وعلاوة على ذلك، تظهر البيانات الترنسكربيتوم غير منشورة في ثقافات ببيكس المشارك الشخصية المتوقعة من الناقلين BBB والمستقبلات (لم تنشر النتائج، نيلسن et al.).

نموذج BBB المستندة إلى الخنزير يتمتع بميزة إضافية الجينوم، والتشريح، وعلم وظائف الأعضاء، وتعكس تطور المرض من الخنازير البيولوجيا البشرية بدرجة أعلى من نماذج أخرى ثابتة ويضم60، التي مواتية صناعة المستحضرات الصيدلانية. كما العقول الخنزير منتج ثانوي مشترك لصناعة اللحوم، أنها تشكل مصدر يمكن الوصول بسهولة للدماغ خلايا بطانية، تقليل عدد الحيوانات اللازمة للتجارب، وتوفير تنقية عالية غلة من المخ الخنزيري واحد. على الرغم من أن زراعة الخلايا الأولية وتنقية تستغرق وقتاً طويلاً إلى حد ما وتتطلب خبرة للتوحيد القياسي في إعداد النموذج، تولد الخلايا الابتدائية نماذج BBB الأكثر موثوقية. خطوط خلية مخلدة لا يمكن أن يكون بديلاً، كخصائص هامة مثل ضيق الحاجز وملامح التعبير الناقل، والتنظيم المكروية لا تعكس النتائج التجريبية في فيفو61، 62-تقديم نماذج في المختبر وميزة خلية يعيش التصوير بدقة أعلى، مما يجعل من الممكن تصور للعمليات داخل الخلايا بالسماح لاتباع نهج مقربة إلى الخلايا عينات أو الملاحظة، باستخدام الأهداف مع تضخم أعلى وأفضل نوعية البصرية63. هذه ليست الحال بالنسبة لاستخدام اثنين-فوتون مجهرية في الحيوانات الحية. وعلاوة على ذلك، توفر نماذج في المختبر القدرة على ترانسفيكت الخلايا، مما يسمح لتصور بروتينات المعلمة والتحقيق في الاتجار بها.

تطبيقات نموذج

وظيفة BBB ليست ثابتة ويمكن أن يكون بشكل حيوي والتضمين في علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض. في الكثير من الأمراض العصبية، بما في ذلك الأعصاب، والالتهابات والأمراض المعدية، واضطراب وزيادة نفاذية BBB يلاحظ64،،من6566،67 . من أجل تقليل ومنع تطور المرض والأضرار اللاحقة، يتم تحديد وتوصيف الآليات الجزيئية الكامنة وراء تحوير BBB أهمية كبرى. وفي هذا السياق، يمكن الاعتماد عليها في المختبر نماذج هي في ارتفاع الطلب في صناعة المستحضرات الصيدلانية، وتلعب أدواراً هامة في التنبؤ نفاذية BBB من المخدرات على الجهاز العصبي المركزي وعلاوة على ذلك. يجب عرض نموذج في المختبر أي يخدم كشاشة نفاذية طريقا باراسيلولار تقييدية، والعمارة خلية فسيولوجيا واقعية والتعبير الوظيفي ل آليات نقل68. أثبتت في الدراسات السابقة16،،من1757، وباراسيلولار النفاذية والتعبير عن بروتينات تي جي وجعفر هنا، نموذج عرض يفي بجميع معايير هذه وهي مناسبة لمجموعة من بي بي بي دراسات في كلا الفسيولوجيا العادية وفي علم الأمراض. نقاط قوة طريقة تنقية وزراعة المقدمة تشمل مزيجاً من البساطة وإمكانية تكرار نتائج والقدرة على تضمين أستروسيتيك التأثير الناتج قوية وموثوق بها عالية طير في المختبر BBB نموذجا. لهذا الغرض، أستروسيتيس من الخنزير والفئران أظهرت المنشأ زيادة النمط الظاهري BBB من ببيكس طريقة مماثلة22.

Protocol

تم الحصول على العقول الخنزير كمشتقات صناعة الأغذية الدانمركية. المجازر الدانمركية تحت إشراف صارم ومراقبة وزارة البيئة الدانمركية والأغذية- ولدت الفئران المستخدمة لعزل astrocytes ويضم الفريق في مرفق الحيوانات المحلية في درجة حرارة المحيطة من 22 درجة مئوية-23 درجة مئوية وعلى دور…

Representative Results

إنشاء BBB نماذج في المختبر في أسلوب عرضها، والأمثل، أجريت زراعة ببيكس وإنشاء نظام إدراج نفاذية الأغشية مع MC أو دون ACM أو NCC مع أستروسيتيس (الشكل 1) لفترة من 9-11 يوما (الشكل 2). لاختيار خلايا بطانية، اقترن ثقاف…

Discussion

تنقية وانتشار للمجلس

أثناء إجراء تنقية، تشمل الخطوات الحاسمة الإزالة السريعة والفعالة للسحايا والفصل بين المسألة الأبيض والرمادي، ومهمة لتنقية الغلة والنقاء وإنشاء النموذج الصحيح. لعرضها في المختبر BBB الطراز باستخدام ببيكس، تحسين وتبسيط إجراء تنقية استناداً إلى تجان…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب يود أن يعترف بروون هيلانة إليزابيث وسارة كريستين كريستنسن نيلز كريستيانسن م. للحصول على المساعدة التقنية، ومنح مؤسسة Lundbeck رقم R155-2013-14113.

Materials

Fibronectin Sigma-Aldrich F1141
Collagen IV Sigma-Aldrich C5533
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P1524
DMEM/F-12 Lonza BE12-719F
DMEM/Low Glucose Sigma-Aldrich D6046
Penicillin/Streptomycin Gibco Invitrogen 15140
Plasma derived serum (PDS) First Link UK Ltd. 60-00-89
Fetal bovine serum (FBS) Gibco Invitrogen 10-270-106
Trypsin/EDTA Gibco Invitrogen 15090-046
Heparin Sigma-Aldrich H3393
Puromycin Sigma-Aldrich P8833
Hydrocortisone Sigma-Aldrich H4001
8-CPT-cAMP Biolog C010
RO 20-1724 Sigma-Aldrich B8279
Gentamicin Sulfate Lonza 17-518Z
DMSO Sigma-Aldrich 34896
PBS Sigma-Aldrich D8537
EtOH VWR 20,824,296 Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH
DNAse 1 Sigma-Aldrich D4513
Collagenase CLS2 Sigma-Aldrich C6885
ddH2O Made with Elga System
T75 flasks Thermo Scientific 156499
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) Costar CLS3401 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane
15 ml centrifuge tubes Cellstar 188271
50 ml centrifuge tubes Cellstar 227261
Petri dishes Thermo Scientific 150350
Cryo vials Thermo Scientific 377224
500 ml bottle Thermo Scientific 159910/159920
Scalpels Swann-Morten REF0211 Type 24
Tissue homogenizer Sigma D9188
140 μm filters MERCK NY4H04700
40 μm filters Corning 431750
EndOhm chamber system World Precision Instruments ENDOHM-12 EndOhm chamber for 12mm Culture Cups
EVOM2 electrode system World Precision Instruments 300523+STX100C TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair
Long needle Sigma Attach to a syringe
Fine-tip curved forceps KLS Martin 12-409-12-07
Broad tip forceps VWR 82027-390
Filter holder MERCK Milipore Swinnex-47
50 ml syringe Braun 4617509F
10 ml syringe Terumo SSt20ESI
Anti-Occludin antibody Abcam ab31721 1:100
Anti-p120 Catenin antibody BD Transduction laboratories 610133 1:200
Anti-ZO-1 antibody Invitrogen 61-7300 1:200
Anti-Claudin 5 antibody Sigma-Aldrich SAB4502981 1:100
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 Thermo Scientific A10042 1:500
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 Thermo Scientific A21202 1:500
Sucrose Perkin Elmer NEC100X250UC 0.15µl/ml final working conc
Lucifer Yellow Sigma L0144 10 µg/ml final working conc
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , 1-29 (2016).
  2. Abbott, N. J., Rönnbäck, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Rev Neurosci. 7 (1), 41-53 (2006).
  3. Hawkins, B. T., Davis, T. P. The blood-brain barrier/neurovascular unit in health and disease. Pharmacol Rev. 57 (2), 173-185 (2005).
  4. Abbott, N. J. Anatomy and Physiology of the Blood-Brain Barriers. Drug Delivery to the Brain SE – 1. 10, 3-21 (2014).
  5. Igarashi, Y., et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces barrier function of endothelial cells forming the blood-brain barrier. Biochem Biophys Res Commun. 261 (1), 108-112 (1999).
  6. Sobue, K., et al. Induction of blood-brain barrier properties in immortalized bovine brain endothelial cells by astrocytic factors. Neurosci Res. 35 (2), 155-164 (1999).
  7. Hoheisel, D., et al. Hydrocortisone Reinforces the Blood-Brain Barrier Properties in a Serum Free Cell Culture System. Biochem Biophys Res Commun. 244 (1), 312-316 (1998).
  8. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke; a journal of cerebral circulation. 30 (8), 1671-1678 (1999).
  9. Takeshita, T., et al. Cilostazol attenuates ischemia-reperfusion-induced blood-brain barrier dysfunction enhanced by advanced glycation endproducts via transforming growth factor-β1 signaling. Mol cell neurosci. 60, 1-9 (2014).
  10. DeBault, L. E., Kahn, L. E., Frommes, S. P., Cancilla, P. A. Cerebral microvessels and derived cells in tissue culture: Isolation and preliminary characterization. In Vitro. 15 (7), 473-487 (1979).
  11. Bowman, P. D., et al. Primary Culture of Capillary Endothelium from Rat Brain. In Vitro IN VITRO Tissue Culture Association. 17 (4), 353-362 (1981).
  12. Bowman, P. D., Ennis, S. R., Rarey, K. E., Lorris Betz, A., Goldstein, G. W. Brain microvessel endothelial cells in tissue culture: A model for study of blood-brain barrier permeability. Annals of Neurology. 14 (4), 396-402 (1983).
  13. Rubin, L. L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  14. Wang, W., Dentler, W. L., Borchardt, R. T. VEGF increases BMEC monolayer permeability by affecting occludin expression and tight junction assembly. American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 280 (1), H434-H440 (2001).
  15. Cantrill, C. A., Skinner, R. A., Rothwell, N. J., Penny, J. I. An immortalised astrocyte cell line maintains the in vivo phenotype of a primary porcine in vitro blood-brain barrier model. Brain Research. 1479, 17-30 (2012).
  16. Patabendige, A., Skinner, R. A., Morgan, L., Joan Abbott, N. A detailed method for preparation of a functional and flexible blood-brain barrier model using porcine brain endothelial cells. Brain Research. 1521, 16-30 (2013).
  17. Patabendige, A., Skinner, R. A., Abbott, N. J. Establishment of a simplified in vitro porcine blood-brain barrier model with high transendothelial electrical resistance. Brain Research. 1521, 1-15 (2013).
  18. Patabendige, A., Abbott, N. J. Primary Porcine Brain Microvessel Endothelial Cell Isolation and Culture. Current Protocols in Neuroscience. 69, 3.27.1-3.27.17 (2014).
  19. Teow, H. M., Zhou, Z., Najlah, M., Yusof, S. R., Abbott, N. J., D’Emanuele, A. Delivery of paclitaxel across cellular barriers using a dendrimer-based nanocarrier. International Journal of Pharmaceutics. 441 (1-2), 701-711 (2013).
  20. Dickens, D., et al. A Multi-System Approach Assessing the Interaction of Anticonvulsants with P-gp. PLoS ONE. 8 (5), e64854 (2013).
  21. Yusof, S. R., Avdeef, A., Abbott, N. J. In vitro porcine blood-brain barrier model for permeability studies: pCEL-X software pKaFLUX method for aqueous boundary layer correction and detailed data analysis. European Journal of Pharmaceutical Sciences. 65, 98-111 (2014).
  22. Thomsen, L. B., Burkhart, A., Moos, T. A Triple Culture Model of the Blood-Brain Barrier Using Porcine Brain Endothelial cells, Astrocytes and Pericytes. PLOS ONE. 10 (8), e0134765 (2015).
  23. Liew, K. -. F., Hanapi, N. A., Chan, K. -. L., Yusof, S. R., Lee, C. -. Y. Assessment of the Blood-Brain Barrier Permeability of Potential Neuroprotective Aurones in Parallel Artificial Membrane Permeability Assay and Porcine Brain Endothelial Cell Models. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (2), 502-510 (2017).
  24. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Kataoka, Y., Niwa, M. Permeability studies on in vitro blood-brain barrier models: physiology, pathology, and pharmacology. Cellular and molecular neurobiology. 25 (1), 59-127 (2005).
  25. Omidi, Y., Campbell, L., Barar, J., Connell, D., Akhtar, S., Gumbleton, M. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990 (1), 95-112 (2003).
  26. Paolinelli, R., et al. Wnt Activation of Immortalized Brain Endothelial Cells as a Tool for Generating a Standardized Model of the Blood Brain Barrier In Vitro. PLoS ONE. 8 (8), e70233 (2013).
  27. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of Immortalized bEnd5 and Primary Mouse Brain Microvascular Endothelial Cells as in vitro Blood-Brain Barrier Models for the Study of T Cell Extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. 31 (1), 315-327 (2011).
  28. Förster, C., et al. Occludin as direct target for glucocorticoid-induced improvement of blood-brain barrier properties in a murine in vitro system. The Journal of Physiology. 565 (2), 475-486 (2005).
  29. Silwedel, C., Förster, C. Differential susceptibility of cerebral and cerebellar murine brain microvascular endothelial cells to loss of barrier properties in response to inflammatory stimuli. Journal of Neuroimmunology. 179 (1-2), 37-45 (2006).
  30. Kleinschnitz, C., et al. Glucocorticoid Insensitivity at the Hypoxic Blood-Brain Barrier Can Be Reversed by Inhibition of the Proteasome. Stroke. 42 (4), 1081-1089 (2011).
  31. Neuhaus, W., et al. Addition of NMDA-receptor antagonist MK801 during oxygen/glucose deprivation moderately attenuates the upregulation of glucose uptake after subsequent reoxygenation in brain endothelial cells. Neuroscience letters. 506 (1), 44-49 (2012).
  32. Neuhaus, W., Gaiser, F., Mahringer, A., Franz, J., Riethmüller, C., Fӧrster, C. The pivotal role of astrocytes in an in vitro stroke model of the blood-brain barrier. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 352 (2014).
  33. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  34. Stamatovic, S. M., Keep, R. F., Kunkel, S. L., Andjelkovic, A. V. Potential role of MCP-1 in endothelial cell tight junction ‘opening’: signaling via Rho and Rho kinase. Journal of Cell Science. 116 (22), 4615-4628 (2003).
  35. Weidenfeller, C., Schrot, S., Zozulya, A., Galla, H. -. J. Murine brain capillary endothelial cells exhibit improved barrier properties under the influence of hydrocortisone. Brain Research. 1053 (1-2), 162-174 (2005).
  36. Deli, M. A., Abrahám, C. S., Niwa, M., Falus, A., et al. N,N-diethyl-2-[4-(phenylmethyl)phenoxy]ethanamine increases the permeability of primary mouse cerebral endothelial cell monolayers. Inflamm Res. 52, S39-S40 (2003).
  37. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97 (4), 922-933 (2006).
  38. Molino, Y., Jabès, F., Lacassagne, E., Gaudin, N., Khrestchatisky, M. Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport. Journal of Visualized Experiments. (88), e51278 (2014).
  39. Rutten, M. J., Hoover, R. L., Karnovsky, M. J. Electrical resistance and macromolecular permeability of brain endothelial monolayer cultures. Brain research. 425 (2), 301-310 (1987).
  40. Cecchelli, , et al. In vitro model for evaluating drug transport across the blood-brain barrier. Advanced drug delivery reviews. 36 (2-3), 165-178 (1999).
  41. Dehouck, M. P., Méresse, S., Delorme, P., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. An easier, reproducible, and mass-production method to study the blood-brain barrier in vitro. Journal of neurochemistry. 54 (5), 1798-1801 (1990).
  42. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  43. Helms, H. C., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. Paracellular tightness and claudin-5 expression is increased in the BCEC/astrocyte blood-brain barrier model by increasing media buffer capacity during growth. The AAPS journal. 12 (4), 759-770 (2010).
  44. Helms, H. C., Madelung, R., Waagepetersen, H. S., Nielsen, C. U., Brodin, B. In vitro evidence for the brain glutamate efflux hypothesis: Brain endothelial cells cocultured with astrocytes display a polarized brain-to-blood transport of glutamate. Glia. 60 (6), 882-893 (2012).
  45. Garberg, P., et al. In vitro models for the blood-brain barrier. Toxicology in Vitro. 19 (3), 299-334 (2005).
  46. Helms, H. C., Hersom, M., Kuhlmann, L. B., Badolo, L., Nielsen, C. U., Brodin, B. An Electrically Tight In Vitro Blood–Brain Barrier Model Displays Net Brain-to-Blood Efflux of Substrates for the ABC Transporters, P-gp, Bcrp and Mrp-1. The AAPS Journal. 16 (5), 1046-1055 (2014).
  47. van der Sandt, I. C., et al. Assessment of active transport of HIV protease inhibitors in various cell lines and the in vitro blood–brain barrier. AIDS. 15 (4), 483-491 (2001).
  48. Schaddelee, M. P., et al. Functional role of adenosine receptor subtypes in the regulation of blood-brain barrier permeability: possible implications for the design of synthetic adenosine derivatives. European journal of pharmaceutical sciences official journal of the European Federation for Pharmaceutical Sciences. 19 (1), 13-22 (2003).
  49. Malina, K. C. -. K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Closing the gap between the in-vivo and in-vitro blood-brain barrier tightness. Brain Research. 1284, 12-21 (2009).
  50. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain research. 818 (1), 65-71 (1999).
  51. Thanabalasundaram, G., Schneidewind, J., Pieper, C., Galla, H. -. J. The impact of pericytes on the blood-brain barrier integrity depends critically on the pericyte differentiation stage. The International Journal of Biochemistry, Cell Biology. 43 (9), 1284-1293 (2011).
  52. Thanabalasundaram, G., El-Gindi, J., Lischper, M., Galla, H. -. J. Methods to Assess Pericyte-Endothelial Cell Interactions in a Coculture Model. Methods Mol Biol. 686, 379-399 (2011).
  53. von Wedel-Parlow, M., Wölte, P., Galla, H. -. J. Regulation of major efflux transporters under inflammatory conditions at the blood-brain barrier in vitro. Journal of Neurochemistry. 111 (1), 111-118 (2009).
  54. Zozulya, A., Weidenfeller, C., Galla, H. -. J. Pericyte-endothelial cell interaction increases MMP-9 secretion at the blood-brain barrier in vitro. Brain Research. 1189, 1-11 (2008).
  55. Mahringer, A., Delzer, J., Fricker, G. A fluorescence-based in vitro assay for drug interactions with breast cancer resistance protein (BCRP, ABCG2). European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 72 (3), 605-613 (2009).
  56. Gutmann, H., Török, M., Fricker, G., Huwyler, J., Beglinger, C., Drewe, J. Modulation of Multidrug Resistance Protein Expression in Porcine Brain Capillary Endothelial Cells In Vitro. Drug Metabolism and Disposition. 27 (8), (1999).
  57. Skinner, R., Gibson, R., Rothwell, N., Pinteaux, E., Penny, J. Transport of interleukin-1 across cerebromicrovascular endothelial cells. British Journal of Pharmacology. 156 (7), 1115-1123 (2009).
  58. Van Gelder, W., Huijskes-Heins, M. I. E., Van Dijk, J. P., Cleton-Soeteman, M. I., Van Eijk, H. G. Quantification of Different Transferrin Receptor Pools in Primary Cultures of Porcine Blood-Brain Barrier Endothelial Cells. Journal of Neurochemistry. 64 (6), 2708-2715 (2002).
  59. Huwyler, J., Drewe, J., Klusemann, C., Fricker, G. Evidence for P-glycoprotein-modulated penetration of morphine-6-glucuronide into brain capillary endothelium. British journal of pharmacology. 118 (8), 1879-1885 (1996).
  60. Walters, E. M., Agca, Y., Ganjam, V., Evans, T. Animal models got you puzzled?: think pig. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245 (1), 63-64 (2011).
  61. Shawahna, R., Decleves, X., Scherrmann, J. -. M. Hurdles with using in vitro models to predict human blood-brain barrier drug permeability: a special focus on transporters and metabolizing enzymes. Current drug metabolism. 14 (1), 120-136 (2013).
  62. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB journal official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  63. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow, Metabolism. , (2017).
  64. Xu, C. -. Y., Zhu, H. -. M., Wu, J. -. H., Wen, H., Liu, C. -. J. Increased permeability of blood-brain barrier is mediated by serine protease during Cryptococcus meningitis. Journal of International Medical Research. 42 (1), 85-92 (2014).
  65. Roberts, D. J., Goralski, K. B. A critical overview of the influence of inflammation and infection on P-glycoprotein expression and activity in the brain. Expert opinion on drug metabolism, toxicology. 4 (10), 1245-1264 (2008).
  66. Correale, J., Villa, A. The blood-brain-barrier in multiple sclerosis: functional roles and therapeutic targeting. Autoimmunity. 40 (2), 148-160 (2007).
  67. Desai, B. S., Monahan, A. J., Carvey, P. M., Hendey, B. Blood-brain barrier pathology in Alzheimer’s and Parkinson’s disease: implications for drug therapy. Cell transplantation. 16 (3), 285-299 (2007).
  68. Gumbleton, M., Audus, K. L. Progress and limitations in the use of in vitro cell cultures to serve as a permeability screen for the blood-brain barrier. Journal of Pharmaceutical Sciences. 90 (11), 1681-1698 (2001).
  69. Franke, H., Galla, H., Beuckmann, C. T. Primary cultures of brain microvessel endothelial cells: a valid and flexible model to study drug transport through the blood-brain barrier in vitro. Brain research. Brain research protocols. 5 (3), 248-256 (2000).
  70. Schulze, C., Smales, C., Rubin, L. L., Staddon, J. M. Lysophosphatidic acid increases tight junction permeability in cultured brain endothelial cells. Journal of neurochemistry. 68 (3), 991-1000 (1997).
  71. Cohen-Kashi-Malina, K., Cooper, I., Teichberg, V. I. Mechanisms of glutamate efflux at the blood-brain barrier: involvement of glial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 32 (1), 177-189 (2012).
  72. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. Journal of cell science. , 23-37 (1992).
  73. Parkinson, F. E., Hacking, C. Pericyte abundance affects sucrose permeability in cultures of rat brain microvascular endothelial cells. Brain Research. 1049 (1), 8-14 (2005).
  74. Perrière, N., et al. Puromycin-based purification of rat brain capillary endothelial cell cultures. Effect on the expression of blood-brain barrier-specific properties. Journal of Neurochemistry. 93 (2), 279-289 (2005).
  75. Dobrogowska, D. H., Lossinsky, A. S., Tarnawski, M., Vorbrodt, A. W. Increased blood-brain barrier permeability and endothelial abnormalities induced by vascular endothelial growth factor. Journal of neurocytology. 27 (3), 163-173 (1998).
  76. Harhaj, N. S., Barber, A. J., Antonetti, D. A. Platelet-derived growth factor mediates tight junction redistribution and increases permeability in MDCK cells. Journal of Cellular Physiology. 193 (3), 349-364 (2002).
  77. Wang, W., Merrill, M. J., Borchardt, R. T. Vascular endothelial growth factor affects permeability of brain microvessel endothelial cells in vitro. The American journal of physiology. 271 (6 Pt 1), C1973-C1980 (1996).
  78. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of neurochemistry. 71 (3), 1151-1157 (1998).
  79. Perrière, N., et al. A functional in vitro model of rat blood-brain barrier for molecular analysis of efflux transporters. Brain Research. 1150, 1-13 (2007).
  80. Calabria, A. R., Shusta, E. V. A genomic comparison of in vivo and in vitro brain microvascular endothelial cells. Journal of cerebral blood flow and metabolism: official journal of the International Society of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 28 (1), 135-148 (2008).
  81. Abbott, N. J., Dolman, D. E. M., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An Improved In Vitro Blood-Brain Barrier Model: Rat Brain Endothelial Cells Co-cultured with Astrocytes. Methods in molecular biology. 814, 415-430 (2012).
  82. Boveri, M., et al. Induction of blood-brain barrier properties in cultured brain capillary endothelial cells: comparison between primary glial cells and C6 cell line. Glia. 51 (3), 187-198 (2005).
  83. Culot, M., et al. An in vitro blood-brain barrier model for high throughput (HTS) toxicological screening. Toxicology in Vitro. 22 (3), 799-811 (2008).
  84. Aigner, B., et al. Transgenic pigs as models for translational biomedical research. Journal of Molecular Medicine. 88 (7), 653-664 (2010).
  85. Naik, P., Cucullo, L. In Vitro Blood-Brain Barrier Models: Current and Perspective Technologies. J Pharmaceutical Sciences. 101 (4), 1337-1354 (2012).
  86. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neuroscience. 12 (1), 40 (2011).
  87. Neuhaus, W., Lauer, R., Oelzant, S., Fringeli, U. P., Ecker, G. F., Noe, C. R. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. Journal of biotechnology. 125 (1), 127-141 (2006).
  88. Griep, L. M., et al. BBB ON CHIP: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomedical Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  89. Prabhakarpandian, B., et al. SyM-BBB: a microfluidic blood brain barrier model. Lab on a Chip. 13 (6), 1093 (2013).
  90. Walter, F. R., et al. A versatile lab-on-a-chip tool for modeling biological barriers. Sensors and Actuators B: Chemical. 222, 1209-1219 (2016).

Tags

Blood-brain BarrierPorcine Brain Endothelial CellsIn Vitro ModelPrimary Cell IsolationCapillary IsolationCell DigestionCell CultureTEERPermeability
check_url/56277?article_type=t&slug=improved-method-for-establishment-an-vitro-blood-brain-barrier-model

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nielsen, S. S. E., Siupka, P., Georgian, A., Preston, J. E., Tóth, A. E., Yusof, S. R., Abbott, N. J., Nielsen, M. S. Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (127), e56277, doi:10.3791/56277 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image