Protokol amacı birincil domuz beyin endotel hücreleri (pBECs) temel alan bir vitro kan – beyin bariyerini (BBB) modeli kurulması için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunmaktır. Modeli gösterir yüksek tekrarlanabilirlik, yüksek gerginlik ve taşıma ve hücre içi ilaç bulma gelen kaçakçılığı için uygundur.
Bu iletişim kuralının amacı ve ekimi pBECs ve vitro kan – beyin bariyerini (BBB) modelleri pBECs mono-kültür (MC), MC astrocyte şartına orta (ACM), ile temel kurmak için en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar ve ortak kültür (NCC) astrocytes, domuz ile temas ya da sıçan kökenli. pBECs izole ve parçaları kapiller beyin cortices aile içi domuz 5-6 aylık üzerinden kültürlü. Bu parçaları dikkatli çıkarılması meninkslerde, yalıtım ve gri madde, filtrasyon, Enzimatik sindirim ve Santrifüjü homojenizasyon tarafından saf. Daha fazla bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için kapiller parçaları ile puromisindir içeren kültürlü orta. % 60-95 birleşmesi, kapiller parçalardan büyüyen pBECs için pasajlı zaman geçirgen membran filtre ekler ve modellerinde kurdu. Bariyer gerginlik ve pBECs BBB karakteristik fenotip artırmak için hücreleri aşağıdaki farklılaşma faktörler ile tedavi edildi: membran permeant 8-CPT-kampı (burada kısaltılmış kampı), hidrokortizon ve bir fosfodiesteraz inhibitörü, RO-20-1724 (RO). Yordamı bir 9-11 gün boyunca yürütülen ve NCC modeli oluşturulurken, astrocytes 2-8 hafta önceden kültürlü. Bağlılık protokolündeki açıklanan yordamlara endotel katmanları kurulması son derece kısıtlı paracellular geçirgenliği ile izin verdi, bir ortalama transendothelial elektriksel direnç (AYLARININ) 1249 ± 80 Ω cm gösterilen NCC ile model 2ve paracellular geçirgenliği (Papp) için Lucifer sarı, 0.90 10-6 ± 0,13 10-6 cm sn-1 (± SEM, yani n = 55). Daha fazla bu pBEC fenotip değerlendirilmesi gösterdi sıkı bileske proteinler claudin 5, iyi ifade ZO-1, occludin ve adherens junction protein p120 catenin. Sunulan model bir dizi sağlık ve hastalığında BBB çalışmaları için kullanılabilir ve çok kısıtlayıcı paracellular geçirgenliği ile bu model taşıma ve hücre içi kaçakçılığı çalışmalar için uygundur.
Hücresel yapısı ve fonksiyonu kan – beyin bariyerini
Dolaşım ve merkezi sinir sistemi (MSS) arayüzü BBB CNS microenvironment kontrolünü homoeostatic için anahtar bir düzenleyici site düzgün ve sinir sisteminin korunması için gerekli olan görevi görür. BBB kan damarı Lümen astar endotel hücreleri sitedir. Beyin kılcal, endotel hücreleri karmaşık hücreler arası sıkı kavşaklar oluşturmak ve belirli akını ve sızma taşıyıcılar güçlü polarize ifade şekillerinin çok özel moleküler taşıma kan ve beyin 1arasında olun. Sıkı bağlantı kompleksleri yapısal bileşenlerini aile occludin ve claudin, zonula occludens (ZO) proteinler, cingulin protein içerir ve bileske adezyon molekülleri (sıkışmaları) ilişkili. Claudin 5 paracellular bileske sınırlama içinde özellikle önemlidir. İndüksiyon ve bu karakteristik BBB endotel fenotip Bakımı dahil ile çevredeki hücreleri, perisitlerden, astrocytes, sinir hücreleri ve Bodrum membranlar, hangi beyin endotel ile birlikte form hücreleri de dahil olmak üzere dinamik etkileşimler nörovasküler birim (NVU)2,3. Bu etkileşimler dahil mekanizmaları henüz tam olarak anlaşılmış değil, ancak exchange BBB geçirgenliği modülasyon kısa vadede sağlar ve uzun vadeli BBB özellikleri4indükler hücreleri arasındaki kimyasal sinyallerin içerir. Astrocytes özellikle beyin endotel hücre fenotip için katkıda bulunmak için bilinen ve düzenleyici faktörler gliyal kaynaklı Nörotrofik faktör (hücre içi kampı etkileyen)5, temel fibroblast büyüme faktörü6gibi bir kaynaktır, hidrokortizon7ve dönüştürme büyüme faktörü β (TGF-β)8. TGF-β, etkisini ancak, tartışılan9olmuştur.
Vivo Vitro BBB
İn vivo çalışmalar BBB Biyoloji değerli bilgiler vermeye devam ediyor. Ancak, hücre kültür modelleri ek anlayışlar sağlamak ve sağlık ve hastalığında BBB detaylı moleküler ve fonksiyonel yönlerini anlamak için yararlı araçlar oluşturur. Hücre tipleri ve BBB bileşenlerinin arasındaki karmaşık etkileşimler vitro modellerinde tam olarak ulaşmak zor olsa da, ortada, beyin endotel hücrelerinin ilk arıtma ve uygulama mono-kültür içinde bu yana 10 , 11 , 12, arıtma işlemleri ve BBB koşullarının büyüme kapsamlı geliştirme kültür modelleri, in vivo bariyer büyük benzerlik sonuçlanan cep. Yaygın olarak kullanılan vitro BBB modelleri kemirgen, domuz ve sığır kökenli Primer hücre ve ölümsüzleştirdi hücre satırlarını temel alır. Her model farklı avantajları ve dezavantajları vardır. Karşılaştırma ve model seçimi için doğrulama işaretleri ifade BBB enzimler, ışınlayıcılar, reseptörleri ve yapısal proteinler gibi geçerli kurulan modelleri1, genel bakış, oluşturmak için kullanılır.
Amaç iletişim kuralı
Önemli özelliklerinden biri: BBB bariyer gerginlik ve yüksek AYLARININ henüz çok sayıda mevcut modelleri de vivo içinde düzeylerini yansıtmak değil. Birkaç laboratuar geliştirme ve en iyi duruma getirme katkılarıyla bir araya getiren, bu iletişim kuralının amacı İlköğretim ile birincil pBECs MC ile ya da ezelî ACM veya NCC temel yüksek AYLARININ vitro BBB modeli oluşturmak için bir yöntem sunmaktır astrocytes fare veya domuz kökenli. Modelinin kurulması ve uygulanan yordamlar çabaları bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırmak için ve pBECs farklılaşma BBB fenotip içine geliştirmek için içerir. Bu eser güvenilir, yüksek AYLARININ modelleri işyerinde düşük paracellular geçirgenliği ve anahtar sıkı bileske proteinler, taşıyıcılar ve reseptörleri iyi işlev ifadesi ile sonuçlandı. Ancak, üç farklı koşul kültürünün astrocytes beyin endotel hücre fenotip bir faktör olarak, üç farklı fenotipleri beyin endotel hücrelerinin temsil eder. NCC modeli nerede BBB özellikleri maksimal ifade, özellikle bazı özel mekanizmalar ilaç bulma, taşıma çalışmaları ve hücre içi kaçakçılığı, ilgili çalışmaların yanı sıra hücre-hücre etkileşimlerin incelenmesi için yararlıdır avantajlı.
Kökeni ve geçmişi iletişim kuralı
Burada açıklanan pBEC modeli Dr. Louise Morgan ve meslektaşları, hangisinin bir başarılı önceki sığır beyin endotel hücre modeli13tarihinde dayalı tarafından büyük ölçüde (Londra) Eisai laboratuarlarında geliştirilen domuz modeli dayanır. Hücre hazırlık özgün yöntem saflık geliştirmek için subculturing bir adım gelir yüzdeki yakalamak için bir iki aşamalı filtreleme naylon kullanarak kafesleri oldu. Yöntemi önceki gelişiminde en uygun BBB fenotip ve bariyer gerginlik desteklenmiştir orta ACM dahil olmak üzere, büyüme elde edildi. Yöntemine yapılan diğer değişiklikler R. Skinner tarafından Prof N. Rothwell’ın Manchester UK14,15laboratuarında yapılmış. Yöntem Abbott laboratuarı, KCL Londra, nerede Patabendige önemli ölçüde astrocytes veya ACM kullanımı kaçınarak ve puromisindir ile perisitlerden gibi bulaşıcı hücreleri ortadan kaldırarak hazırlamak basit yapılmış tarafından kabul edilmiştir. MC model birkaç önemli şekil-in vivo BBB, etkili sıkı kavşaklar, membran taşıma sistemleri ve reseptör aracılı transcytosis16,17 gibi korunmuş ilk kağıtları doğruladı , 18 , 19 , 20. daha sonra S. Yusof tekrar test astrocyte ortak kültür ve bu belirgin bir biçimde iyileştirilmiş AYLARININ, yani bu şu anda Abbott laboratuarı21‘ kullanılan tercih edilen varyant bulundu. Model başarıyla oldu M. Nielsen transfer başka değişiklikler nerelerdeydin Aarhus, laboratuarda (Bu iletişim kuralı) tanıttı, ayıklama, tek bir kafes filtrasyon adım ve bir tek filtre kaplama adım kullanarak kolaylaştırmaya gri de dahil olmak üzere önemli kollajen ve fibronektin birleştirerek. Domuz astrocytes (Bu iletişim kuralı) yalıtım için uygulanan prosedür Thomsen ve ark22tarafından açıklanan Aalborg, T. Moos laboratuvarda tarafından geliştirilen iletişim kuralları dayanıyordu. AYLARININ ve Londra ve Aarhus içinde oluşturulan modeli diğer özelliklerini hangi model labs arasında kolayca aktarılır ve iyi dikkatli gözlem ve rasyonalizasyon yöntemi adımlardan yanıt kavramına güven ödünç benzerdir. Nitekim, S. Yusof şimdi yerel koşullara ve doku kaynakları için daha fazla ayarlama dahil bir tropik ülke (Malezya) yılında23, MC model kurmuştur.
Avantajları alternatif yöntemler üzerinde ve şu anda modelleri kurulan
Sığır ve kemirgen kökenli beyin endotel hücrelerine kıyasla, pBECs yalıtım24takip vivo BBB fenotip kaybı daha düşük bir oranı sahip olmanın avantajı sağlar. Ayrıca, pBECs MC (800 Ω cm2)16 monolayers bEND.5 ve bEND.3 (50 Ω cm2) gibi hücre hatları için yaygın olarak bildirilen düzeyleri ile karşılaştırıldığında bile yetiştirilen nispeten sıkı endotel engelleri, şekillendirme yeteneğine 25 , 26 , 27, cEND (300-800 Ω cm2)28,29,30ve cerebEND (500 Ω cm2)29,31,32ve birincil beyin fare (100-300 Ω cm2) endotel hücreleriSS = “xref” > 33,34,35,36 ve fare (100-300 Ω cm2)37,38. Bununla birlikte, AYLARININ bağımlılık üzerinde arıtma ve kültür yordamlar göstermektedir. Çoğu durumda, ACM eklenmesi veya astrocytes ile ortak kültür endotel Katmanlar1gerginlik endotel hücreleri ve artış ayırt edici etkileri gösterir. Yine de, çabaları ile kodlamayla koşulları en iyi duruma getirmek için sadece sığır tabanlı modeller AYLARININ değerleri domuz tabanlı modeller (800 Ω cm2 ‘ MC, en çok astrocyte ortak kültür 2500 Ω cm2 Ortalamalar) karşılaştırılabilir göstermiştir13 ,39,40,41,42,43,44,45. Birincil sığır beyin üzerine alan modelleri olarak endotel hücreleri büyük varyasyon, laboratuvarlar14,45,46,47,48içinde ve arasında göstermiştir, tekrarlanabilirlik bir sorun olabilir. Rapor burada pBEC modelinde katkıda bulunan laboratuvarlar çok benzer AYLARININ ve paracellular geçirgenlik değerleri düşük değişkenliği hem de laboratuvarlar arasında ile elde ettik. Bu nedenle, burada sunulan yöntemiyle düşük değişkenliği ile güçlü bir modeli kurmak diğer laboratuarlar için mümkün olmalıdır. Sıkı endotel Katmanlar oluşturan ek olarak, pBECs modelleriyle daha önce ifade ve sıkı kavşak proteinler, fonksiyonel BBB taşıyıcılar, reseptörleri ve enzimler, gösterdiği için uygunluğunu test bir dizi çalışmalar15 tarafından doğrulanmış , 16 , 17 , 19 , 20 , 22 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54 , 55 , 56 , 57 , 58 , 59. Ayrıca, yayınlanmamış transcriptome veri pBECs ortak kültürü üzerinde BBB taşıyıcılar ve reseptörleri (yayınlanmamış sonuçları, Nielsen vd.) beklenen bir profili gösterir.
Domuz tabanlı BBB modeli daha fazla avantajı vardır genom, anatomi, Fizyoloji ve hastalık ilerleme domuz yansıtmak olumlu olan60, özellikleri için kurulan diğer modellere kıyasla daha yüksek bir dereceye insan biyolojisi ilaç endüstrisi. Domuz beyin et endüstrisi ortak bir yan ürün olduğu için onlar deneyler için gerekli ve bir domuz beyin üzerinden yüksek arıtma verimi sağlayan hayvanlar sayısını en aza indirme endotel hücreleri, beyin kolayca erişilebilir bir kaynak oluşturmaktadır. Arıtma ve Primer hücre tarımı biraz zaman alıcı ve model kurma standardizasyon uzmanlık gerektirir rağmen Primer hücre en güvenilir BBB modelleri oluşturma. Bariyer gerginlik, ışınlama ifade profilleri ve microenvironment yönetmelik deneysel bulgular vivo içinde61, yansıtmıyor gibi ölümsüzleştirdi hücre hatları yerine, önemli özellikler olarak olamaz 62. vitro modeller canlı hücre daha yüksek çözünürlükte görüntüleme, görselleştirme hücre içi süreçlerin bir yakın yaklaşım kullanarak hedefleri örneklenen veya gözlenen hücrelere izin vererek mümkün hale avantajı sağlamak yüksek büyütme ile daha iyi optik kalitesi63. İki fotonlu mikroskobu yaşayan hayvanlarda kullanımı böyle değildir. Ayrıca, vitro modelleri hücreleri, görselleştirme tagged proteinlerin ve onların ticareti soruşturma izin transfect olanağı sağlar.
Uygulama modeli
BBB işlevi sabit değildir ve dinamik olarak fizyolojisi ve patoloji modülasyonlu. Nörodejeneratif, dahil olmak üzere birçok nörolojik hastalıklarda enflamatuar ve bulaşıcı hastalıklar, bozulma ve BBB geçirgenliği artmıştır gözlenen64,65,66,67 . Azaltmak ve hastalık ilerleme ve sonraki zarar önlemek için kimlik ve BBB modülasyon temel moleküler mekanizmaları karakterizasyonu büyük önemi vardır. Bu bağlamda güvenilir vitro modelleri ilaç endüstrisi tarafından yüksek talep ve ayrıca MSS ilaçlara geçirgenliği BBB öngörmede önemli rol oynarlar. Geçirgenliği ekran hizmet veren herhangi bir vitro model bir kısıtlayıcı paracellular yol, bir fizyolojik gerçekçi hücre mimarisi ve ışınlama mekanizmaları68fonksiyonel ifade görüntülenmelidir. Önceki çalışmalar16,17,57ve paracellular geçirgenliği ve ifade burada TJ ve AJ proteinlerin gösterdi, sunulan model bu kriterleri karşılayan ve BBB bir aralığı için uygundur çalışmalar her iki normal Fizyoloji ve patoloji. Sunulan arıtma ve ekimi yönteminin güçlü basitlik birleşimini içerir ve tekrarlanabilirlik ve yetenek astrositik dahil bir elde edilen sağlam ve güvenilir yüksek AYLARININ vitro BBB modeli ile etkiler. Bunun amacı, astrocytes, domuz ve sıçan kökenli pBECs benzer bir şekilde22BBB fenotip artırmak için gösterilmiştir.
Arıtma ve hızla çoğalmak-in pBEC
Arıtma işlemi sırasında kritik adımlar meninkslerde hızlı ve etkili kaldırma ve ayırma arıtma verimi ve saflık ve model uygun kurulması için önemlidir beyaz ve gri madde içerir. PBECs kullanarak sunulan vitro BBB modeli için Biz Geliştirilmiş ve mekanik homojenizasyon izole gri madde boyutu-seçici yüzdeki, sindirim collagenase ile yalıtım için filtre uygulama dayalı bir arıtma yordam Basitleştirilmiş , Dnaz ve Tripsin, ilk b…
The authors have nothing to disclose.
Lundbeck Vakfı Hibe numarası R155-2013-14113 ve yazarlar Elisabeth Helena Bruun, Sarah Christine Christensen ve Niels M. Kristiansen için teknik yardım kabul etmek istiyorum.
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | |
Collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P1524 | |
DMEM/F-12 | Lonza | BE12-719F | |
DMEM/Low Glucose | Sigma-Aldrich | D6046 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco Invitrogen | 15140 | |
Plasma derived serum (PDS) | First Link UK Ltd. | 60-00-89 | |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco Invitrogen | 10-270-106 | |
Trypsin/EDTA | Gibco Invitrogen | 15090-046 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3393 | |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H4001 | |
8-CPT-cAMP | Biolog | C010 | |
RO 20-1724 | Sigma-Aldrich | B8279 | |
Gentamicin Sulfate | Lonza | 17-518Z | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 34896 | |
PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
EtOH | VWR | 20,824,296 | Mix the 70 % solution from the 96 % EtOH |
DNAse 1 | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Collagenase CLS2 | Sigma-Aldrich | C6885 | |
ddH2O | Made with Elga System | ||
T75 flasks | Thermo Scientific | 156499 | |
Costar Transwell inserts (Cell permeable membrane inserts) | Costar | CLS3401 | 12-well plate, 12 mm diameter, 0.4 μm polycarbonate membrane |
15 ml centrifuge tubes | Cellstar | 188271 | |
50 ml centrifuge tubes | Cellstar | 227261 | |
Petri dishes | Thermo Scientific | 150350 | |
Cryo vials | Thermo Scientific | 377224 | |
500 ml bottle | Thermo Scientific | 159910/159920 | |
Scalpels | Swann-Morten | REF0211 | Type 24 |
Tissue homogenizer | Sigma | D9188 | |
140 μm filters | MERCK | NY4H04700 | |
40 μm filters | Corning | 431750 | |
EndOhm chamber system | World Precision Instruments | ENDOHM-12 | EndOhm chamber for 12mm Culture Cups |
EVOM2 electrode system | World Precision Instruments | 300523+STX100C | TEER measurement system with rigid STX-100C electrode pair |
Long needle | Sigma | Attach to a syringe | |
Fine-tip curved forceps | KLS Martin | 12-409-12-07 | |
Broad tip forceps | VWR | 82027-390 | |
Filter holder | MERCK Milipore | Swinnex-47 | |
50 ml syringe | Braun | 4617509F | |
10 ml syringe | Terumo | SSt20ESI | |
Anti-Occludin antibody | Abcam | ab31721 | 1:100 |
Anti-p120 Catenin antibody | BD Transduction laboratories | 610133 | 1:200 |
Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 61-7300 | 1:200 |
Anti-Claudin 5 antibody | Sigma-Aldrich | SAB4502981 | 1:100 |
Donkey anti rabbit IgG conjugated with Alexa Flour 568 | Thermo Scientific | A10042 | 1:500 |
Donkey anti mouse IgG conjugated with Alexa Flour 488 | Thermo Scientific | A21202 | 1:500 |
Sucrose | Perkin Elmer | NEC100X250UC | 0.15µl/ml final working conc |
Lucifer Yellow | Sigma | L0144 | 10 µg/ml final working conc |