교 잡 프로토콜 설명된 RNA 제자리에 전체 초파리 배아 또는 해 부 조직에서 RNA의 검출을 허용 한다. 96-잘 결정 접시와 tyramide 신호 증폭에 사용 하 여, 성적 감지할 수 있습니다 높은 해상도, 감도, 및 처리량, 그리고 상대적으로 저렴 한 비용.
표현의 패턴 및 초파리 게놈 넓은 기준 RNAs의 subcellular 지 방화를 결정 하기 위해 노력 하 고 다양 한 조직에에서, 우리 우리의 원래 형광 현장에 수많은 수정 및 향상 된 개발 했습니다. 교 잡 (물고기) 프로토콜. 처리량 및 비용 효율성을 촉진 하기 위하여 신호 검출 프로브 세대에서 모든 단계는 exon 결정 96 잘 접시를 사용 하 여 수행 됩니다. Digoxygenin (파)-이라는 antisense RNA 프로브 템플릿으로 게놈 DNA 또는 cDNA 클론을 사용 하 여 생산 됩니다. 조직 고정 permeabilization 후에, 프로브는 성적 관심에 때 교배 하 고 biotin, streptavidin 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)를 활용 하 고 붙일 활용에 활용 된 안티 발굴 항 체의 승계를 사용 하 여 검색 tyramide, HRP, 존재는 즉시 인접 한 단백질의 전자 밀도가 지역에는 반응성이 매우 높은 중급. 이러한 증폭 및 지역화 단계 두 세포 및 subcellular 사본 지역화를 용이 하 게 하는 강력 하 고 매우 지역화 된 신호를 생성 합니다. 제공 하는 프로토콜은 다양 한 조직 및 발달 단계에서에서 매우 구체적인 신호를 생산 하기 위해 최적화 되었습니다. 참조 또한 동시에 여러 성적 증명서 또는 성적 증명서 및 단백질의 동시 탐지를 허용 하는 추가 변이 대 한 제공 됩니다.
RNA-seq 같은 새로운 RNA 게놈 넓은 탐지 방법 우리의 지식과, 유전자 표현는 언제, 어디의 무슨 레벨1에서 크게 확대. 그러나,이 상대적으로 가난한 시간적, 공간적 해상도 제공합니다. RNA 제자리 교 잡에 따라서 세포 및 subcellular 지 방화2의 세부 사항을 공개 고정 조직, 시각적으로 관찰 기록의 공간 배급을 허용 한다. 형광 성 제자리 교 잡 (물고기)를 사용 하 여 더 많은 공간 해상도를 confocal 빛 시트 현미경3같은 강력한 현미경 검사 법 기술의 사용을 허용 수 있습니다. DAPI 같은 형광 마커 subcellular 관계4설정에 사용할 수 있습니다. 물고기는 또한 subcellular 수준에서 중복의 명확한 표시와 동시에 여러 개의 RNAs 단백질의 관측을 촉진 한다. 독특한 시 약 및 더블 라벨에 필요한 단계는 다음 참조3,5에서 찾을 수 있습니다.
여기에 설명 된 절차 96 잘 결정 플레이트 cDNA 템플릿 생산 (식민지 PCR), RNA 프로브 생산 (T7, T3 또는 SP6 중 합 효소 종속 실행 전사 사용) 에서 제자리 교 잡를 포함 하 여 모든 단계에 대 한 활용 및 형광 신호 개발입니다. 충분 한 수의 배아 또는 조직 각각에 추가 됩니다 수 있도록 일관성과 다양성의 평가 96 잘 접시의 잘. 각 그럼 다른 조사를 받습니다. 신호 개발 후 배아 또는 각 우물에서 조직 현미경 분석에 대 한 개별 현미경 슬라이드에 짓고 있다.
프로브 탐지를 위한 tyramide 신호 증폭 (TSA)를 사용 하 여 뛰어난 subcellular 해상도 5,6,,78강력한 신호를 생성합니다. RNAs의 subcellular 지 방화 발생 하는 거의 모든 RNAs 4,,1011에 표시 되는 중요 한 규제 메커니즘 9 입니다. 이 분석에서는 RNA-seq에 의해 검색 되지 않은 많은 성적은 쉽게 물고기 8에서 검색도 나타났습니다. RNA 교 잡 제자리에서 96 잘 접시에 적응 한 번에 (추가 하는 경우 더 많은 접시를 사용), 큰 데이터 집합의 분석을 가능 하 게 관심의 최대 96 유전자의 분석을 수 있습니다. 작은 섹션으로 번호판을 절단 하 여 메서드는 단지 몇 가지 샘플을 쉽게 적응 됩니다. 제공 하는 프로토콜은 대부분의 유형의 조직에서 RNA 배포판의 분석에 적합 합니다. 표시 되지 않습니다, 그것은 비-초파리 조직으로 잘 적응할 수 있는입니다.
표 7: 교 잡 솔루션. 3. 초파리 양육 및 배아, 애벌레와 성인 조직 컬렉션. 참고: 작은 규모 (병)와 질량 (상자) 양육 비행, 비행 실험실 표준 프로토콜을 사용 하 여 25 ° C. 유지 적절 한 성인 및 애벌레 밀도에 cornmeal 기반으로 음식에 고 추가 활성 효 모 분말 식품에 제공 표면. 표준 프로토콜을 수행 하는 수집 배아 배아 컬렉션의 주요 단계는 그림 3에 나와. 참고: 메탄올에 devitillinized 배아를 rinsing 후 고정된 배아 저장할 수 있습니다-20 ° C에서 최대 1 년. 태아 permeabilization와 후 고정 물고기 프로토콜의 1 일에 수행 됩니다. 준비 신선한 40 %PFA 재고 솔루션입니다. DEPC의 10 mL를 혼합 하 여 40 %paraformaldehyde (PFA)의 준비 갓 만든된 재고 솔루션 치료 ddH 2 O PFA 및 포함 하는 작은 저 어 바 20 mL 유리 섬광 유리병에 2N 코의 70 µ L의 3.68 g 주의: PFA 잠재적인 급성 및 만성 건강 효과와 매우 독성이 있다. MSDS (물질 안전 데이터 시트)을 읽었고 눈, 피부, 그리고 호흡 기관에 대 한 적절 한 보호와 함께 사용. 연기 후드, 열에 PFA 완전히 해산 될 때까지 200 ° C에서 난방 접시에 3-5 분에 대 한 유리병을 저 어. 최대한 빨리는 PFA 해산 열에서 PFA 재고 솔루션을 제거 (과열 되지 않습니다). 5 분 동안 얼음에 녹아 40 %PFA 재고 솔루션을 냉각 하 고 0.2 µ m 필터와 10 mL 주사기 필터링. 3 탈피 하는 애벌레 (L3) 또는 성인 조직 고정, 냉각 및 permeabilization 참고:이 프로토콜은 하루에 완료 되어야 합니다. 그것은 포함 하는 조직을 절 개, 고정, 생 HRP, permeabilization 및 후 고정 냉각. 준비 고정 솔루션 (수정-I 및 수정-II)에 의하여 표 8. 참고: Picric 산 사용 됩니다 추가 정착 액으로 조직 된 섬세 한 구조를 유지 해야 합니다. 그것은 좋은 정착 제 때 열 대권 외의 조직 전자 현미경 검사 법 (EM)에 대 한 유지 해야 합니다. 경고: Picric 산 불안정 및 다른 재료와 함께 반응과 폭발성 화합물을 만들 수 있다. 사용 및 안전 지침에 따라 저장. 장소 애벌레 또는 성인 파리 차가운 1x PBS의 10 mL와 수정 100 µ L를 포함 하는 50 mL 플라스틱 튜브에서-난 솔루션. 애벌레 또는 성인 플라이 운동 성 감소를 2 분 동안 얼음에 진정. 컷 2-3 m m 오프닝 만들려고 1 mL 플라스틱 팁의 끝에서. 10-30 애벌레 전송 또는 성인 파리 1 mL 팁과 페 트리 접시 (지름 9 c m)으로 1 X PBS의 얕은 층으로 50 mL 튜브 (3.3.2 단계)에서. PBTT의 비트를 추가 하는 것은 표면 장력 줄일 수 있습니다. 신중 하 게 해 부하는 애벌레 (앞쪽에서 열고 앞쪽에 후부에서 조직을 짜) 또는 해 범위에서 날카로운 집게의 쌍에 대 한 관심의 성인 조직. 참고: 약 200-300 애벌레 또는 성인 testes 수 수 해 부하 고 숙련 된 개인에 의해 하루에 고정. 전송 해 부 200 µ L 피펫은 조직 (여 2 mm 직경을 만들려고 잘라 팁)과 1.5 mL 튜브와 얼음에 저장소에. 다음 단계로 진행 하기 전에 10-15 분 이내 해 부의 각 라운드를 완료. 참고: 계속 추가 라운드 (2 h 시간 창)에서 충분 한 자료를 생성 하는 데 필요한 대로. 수정 조직 800 µ L의 수정-난 벤치 가기 믹서에 30 분을 위한 솔루션. 일단 800 µ L 1 X PBTT와 최대 30 분으로 2.5 헤 아이스 튜브 유지 린스 조직 제한, 충분 한 조직 수집 때까지 batch-wise 수행이 요구. 뚜껑에 메시를 포함 하는 단일 15 mL 플라스틱 관으로 모든 해 부 및 고정 조직 수영장 (튜브 디자인 그림 4 참조). 과잉 액체는 관 뚜껑에 메시를 통해 발음 3 X 5 분 각각 10 mL와 함께 1 X PBTT의 세척. 세제를 제거 하려면 1 X PBS의 10 mL로 두 번 씻어. 그러면 다음 단계에서 과잉 거품. 참고: 경우 튜브의 아래쪽에는 침 몰 하는 해 부 조직, 단계에서 수행할 수 있습니다 일반 결정 또는 0.5-1.5 mL microcentrifuge 튜브 (튜브 당 300-800 µ L 볼륨). 는 0.3% H 2 O 2 PBS에 실시간 반복에서 15 분의 5 mL와 함께 내 생 HRP 활동을 한 번 더 끄다. 뜨고 뚜껑이 단계 혼합 하지 않고. 1 X PBTT의 10 mL를 사용 하 여 두 번으로 하는 린스 1 X PBTT의 10 mL와 5 분 동안 두 번 세척. Permeabilize 80% 아세톤 (-20 ° C, 미리 냉장) 10 mL와 조직-20 ° C 10 분 반전에서 튜브 인큐베이션 기간 동안 두 번. 조직 rehydrate 하 1 X PBTT의 10 mL와 10 분 동안 두 번 세척. 린스 5 ml PBTT 플러스 5 ml 교 잡의 10 mL 혼합 솔루션 (1:1). 믹스를 폐기 하 고 10 ml 교 잡 솔루션으로 대체. 샘플-20 ° C까지 필요에 저장할 수 있습니다. 최상의 결과 얻으려면 저장 하지 마십시오 샘플 1 주일 이상에 대 한. 구성 요소 II (10 ml)을 수정 수정 I (10 ml) 40 %PFA 주식 1 ml 1 ml PBTT 8.99 ml 9 ml Picric 산 용액 10 μ –
표 8: 조직에 대 한 해결 솔루션. 4. 제자리에서 교 잡 참고: 프로토콜의이 부분은 필요한 최소 2 일, 샘플 준비, 사전 교 잡 및 교 잡 복용에 하루 1과 프로브 탐지에 배치 2 일입니다. 샘플의 수는 상대적으로 높은 경우 익숙하지 않은 프로토콜, 또는 하루 종일 불가능, 프로토콜 3 일 2 일간 나누어 프로브 탐지 및 신호 증폭의 단계에서 수행 되어야 합니다. 배아 또는 해 부 조직 샘플의 많은 또한 추가적인 일을 처리 해야 합니다. 달리 명시 하지 않는 한 해 부 조직 샘플에 대 한 모든 단계에 1 X PBTT으로 1 X PBT를 바꿉니다. 추가 세제는 많은 애벌레와 성인 조직, 뇌, 고환 등의 침투에 대 한 필요 합니다. 비록 테스트 하지 1 X PBTT는 태아에 대 한 또한 사용할 수 있습니다. 잘 당 100 µ L를 사용 하 여 96 잘 접시 및 1.5 mL 튜브에 대 한 800 µ L. 사전 교 잡 및 교 잡 참고: 단계 4.1.1-4.1.6.2는 태아에서 제자리 교 잡에 대 한. 내 현장에서 애벌레 또는 성인 조직에 대 한이 단계를 건너뜁니다. 새 15 mL 튜브에 고정된 배아 (-20 ° C에서의 메탄올에 저장)의 제거 2 mL . 각 세척에 메탄올 10 mL와 함께 7 분에 대 한 두 번 배아를 씻어. Wa쉬 배아 10 mL의 혼합물 메탄올 및 1 X PBTT (1:1)와 7 분. 씻어 rehydrate 1 X PBTT의 10 mL와 함께 7 분 동안 두 번 배아. 태아 permeabilization에 대 한 재고 솔루션 (20 mg/mL)에서 1: 500을 diluting 하 여 중간 성분을 K 솔루션 (40 µ L/mL)을 준비. 스토어-20 ° C. 확인 2.667 ug/mL의 최종 작업 집중에 대 한 1 X PBTT에서 중간 성분을 K 솔루션 1/15을 diluting 하 여 작업 가수분해 K 솔루션. Permeabilize 배아 가수분해 K 솔루션 (배아의 작은 숫자에 대 한 더 적은 사용) 작업의 10 mL와 함께. 13 분 부드럽게 반전 튜브 4 회는 인큐베이션 기간 동안 대 한 RT에서 튜브를 품 어. 혼합 하지 않고 1 시간에 대 한 얼음에 가수분해 K 솔루션에서 샘플을 품 어. 참고: 희석 가수분해 K 가진이 비교적 긴 외피 보장 reproducibly 균일 한 permeabilization 및 후속 얼룩. 배아 permeabilize, 동안을 2 mg/mL 10 X 재고 (20 mg/mL)에서 글리신 솔루션 30 mL의 전체 볼륨에 대 한 1 X PBTT. 제거 성분 K 솔루션, 글리신 솔루션 (2 mg/mL)의 10 mL로 씻어 고 2 분 동안 두 번 씻어. 세 번은 글리신을 제거 하려면 1 X PBTT의 10 mL로 씻어. 배아의 후 고정입니다. 준비 4%의 10 mL PFA (40%의 1 mL PBTT의 9 ml PFA 0.45 μ m 필터를 통해 필터링). 4%에서 샘플을 품 어 20 분 세척 3 X 2 분에 대 한 PBTT와 PFA. 변성된 교 잡 솔루션을 준비 하는 교 잡 솔루션을 5 분 끓인 다. 전체 96 잘 접시 12 mL의 3 개의 튜브를 사용 합니다. 5 분에 대 한 즉시 얼음에 멋진 1 X PBTT의 10 mL를 한번 린스 배아: 교 잡 솔루션 (1:1). 하이브리드 솔루션의 5 mL로 두 번 씻어. Aliquot ~ 20 µ L의 당 또는 태아 (배아 30-40)을 해결 하는 조직 얼음에 96-잘 PCR 플레이트에 고정. 조직 또는 태아는 8 개 채널 매니폴드 피 펫 ( 그림 1 / 비디오)를 사용 하 여 교 잡 솔루션 제거. 참고: 매니폴드 피펫으로는 ‘ 중지 ’ 우물의 바닥 하 고 샘플을 제거에서 팁 방지. 실험 조직 플 로트를 사용 하 여, 위에서 신중 하 게 100 µ L 피펫으로 액체 제거. 각 잘 변성된 교 잡 솔루션의 추가 100 µ L. 중 금속 구슬 (자료 및 그림 1 참조)를 포함 하는 마른 목욕 난방 장치를 사용 하 여 56 ° C에서 2.5-3 h의 최소 배아 교배. 5 분 동안 얼음에에서 80 ° C. 즉시 차가운 5 분을 thermocycler를 사용 하는 96-잘 PCR 접시에서 변성 100 µ L 준비의 조사. 배아 또는 조직에서 사전 교 잡 솔루션을 제거 합니다. 추가 각 변성된 유전자 특정 프로브 샘플, 바다 표범 어업 테이프 커버 및 난방 장치와 건조 목욕에 금속 구슬에서 16-18 h O/N, 56 ° C에서 교배 5. 프로브 탐지 미리 따뜻한 56 ° C 난방 장치에서 표 9에 솔루션. 접시에서 프로브를 제거. 참고: 프로브 사이 다시 사용할 수 있습니다 2-3 번-80 ° C (결코 저장소 어떤 RNA 샘플-20 ° c에서)에 저장 하는 경우. 교 잡 후 이중 좌초 RNA 단일 가닥 RNA 보다 더 안정적 이며 RNase 오염으로 인 한 저하 적습니다. 사용 하는 경우는 다 잘 판 진공 여과 시스템, 조직에 대 한 수집 (어셈블리 자세한 동영상 참조) 프로브를 필터 플레이트 아래 컬렉션 접시를 포함. 교배 시킨된 조직 일반 96 잘 결정 접시 1.2 µ m 기 공 크기 PVDF 막 각 우물의 바닥에와 하나로 교 잡에 대 한 사용에서 전송 해야 합니다. 단계 솔루션 (56 ° C)를 미리 예 열 시간 잘 당 볼륨 1 교 잡 솔루션: PBTT (3:1) 15 분 100 μ 2 교 잡 솔루션: PBTT (3:1) 15 분 100 μ 3 교 잡 솔루션: PBTT (1:1) 15 분 100 μ 4 교 잡 솔루션: PBTT (1:3) 15 분 100 μ 5 PBTT 3 세척 5 분 100 μ 표 9: 교 잡 후 프로브를 세척. 일반 접시, 56 난방 단위에서 표 9에 의하여 워시 샘플을 사용 하는 경우 ° C. 경우 진공 매니폴드 시스템을 사용 하 여 온수 솔루션을 사용 하 여 벤치에 진공 시스템 및 vaccuum에 의해 아래에서 즉시 솔루션을 제거. 1 X PBTT와 3 세척 후 일반 접시가 열에서 제거할 수 있습니다 장치 준비 항 체입니다. Biotin 활용 된 마우스 단일 클로 널 항 발굴 항 체를 diluting 하 여 재고 (1 mg/mL)에서 1 차적인 항 체 솔루션 (2.5 µ g/mL)의 준비 11 mL (소재 목록 참조) PBTTB (1:400)에서. 적은 샘플을 처리 하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정. 준비 11 mL 1:1000 streptavidin HRP를 diluting 하 여 재고 (1 mg/mL)에서 동작 하는 streptavidin HRP 솔루션 (1 µ g/mL)의 PBTTB에서 (소재 목록 참조) 켤레. 적은 샘플을 사용 하는 경우 그에 따라 볼륨을 조정. 배아 또는 실시간에 벤치 가기 믹서에 20 분에 대 한 PBTTB (1 X PBTT에서 1% 탈지 우유)와 조직 차단 참고: 필터 PBTTB 필터 막힘 방지 필터 96 잘 접시에 그것을 사용 하기 전에 필터 종이 (학년 3, 6 µ m)를 사용 하 여. PBTB, PBTTB 대신 (추가 0.3 %PBTB-x-100) 프로토콜 중 모든 조직에 대 한 사용 됩니다. 품 배아 또는 벤치 탑 샘플 믹서에 2 h 항 체 솔루션 (100 µ L/잘) 조직. 1 두 번 린스 x PBTTB. 3 세척 5 분 및 5 X X 10 분 PBTTB. 배아 또는 streptavidin HRP 솔루션 (100 µ L/잘) 1.5 h 벤치탑 샘플 믹서를 사용 하 여 조직에 품 어. 세척 2 X 5 분 PBTTB. 이 시점에서 어둠 속에서 샘플 계속. 참고: 모든 항 체 세척, 동안 조직 불투명도 우유 생산으로 인해 손실 되는, 시도 우유 (PBTTB 대신 PBTT) 없이 세척. Diluting 100 DAPI 솔루션 준비 PBTTB (1: 100)에 X DAPI. 품 배아 또는 DAPI 솔루션 (100 µ L/잘) 벤치 탑 샘플 믹서에 15 분에 대 한 조직. 씻어 4 X 10 분 PBTT. 샘플 O/N 4 ° C에 96 잘 접시를 저장 하거나 다음 단계로 진행. 참고: 프로시저 일시 중지할 수 있습니다 여기. 6. 항 체 탐지 tyramide를 사용 하 여 ( 그림 5 참조) 참고: 여기 수 제 cyanine 3 활용 tyramide 사용 되었다,이 프로토콜에서 설명에 따라 준비 되었다 12 . 많은 실험을 수행 하거나 많은 샘플 테스트,이 돈 상당한 금액을 저장 하는 경우은 효과에 비해 상업용 시 약 (경험)에서. 적은 실험 및 샘플, 상용 cyanine 3-tyramide 사용할 수 있습니다 (자료 참조). 워시 샘플 접시 3 X 5 분 1 X PBTT와. 준비 tyramide 활성화 (활성화 버퍼) 들어 있는 버퍼 PBTT (희석 30% (w/w) H 2 O 2 주식 1: 5000)에서 H 2 O 2의 0.006%. 활성화 버퍼와 접시를 씻어. 15 mL 튜브에 활성화 버퍼에 그것을 diluting 하 여 준비 cyanine 3 tyramide 솔루션. 배아를 사용 하 여 1:80 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 137 µ L). 애벌레의 조직에 대 한 1:150 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 73 µ L)을 사용 합니다. 성인 고환에 대 한 1: 200 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 55 µ L)을 사용 합니다. 성인 난소에 대 한 1:300 희석 (cyanine 3-tyramide 활성화 버퍼의 11 ml에서의 36 µ L)를 사용 하 여. 벤치탑 샘플 믹서에 2 h cyanine 3 tyramide 솔루션 샘플을 품 어. PBTT 4 번 린스 합니다. 씻어 6 X 10 분 PBTT. 워시 3 X 5 분에 대 한 세제를 제거 하는 PBS. 추가 150 µ L/잘 방지 페이드의 설치 미디어. 조직 또는 배아 튜브의 하단에 싱크대를 허용 하려면 4 ° C에서 샘플 O/N을 계속. (아래 조직에 대 한 범위 해 부) 현미경 슬라이드에 샘플을 탑재 하 고 coverslip 커버. 투명 매니큐어와 coverslip의 가장자리를 밀봉. 형광 현미경을 사용 하 여 이미지. 참고: 분석의 아이디어를 얻으려면 먼저 부정적인 제어 ‘ 일반적인 ’ 배경.
설명된 프로토콜 고정 초파리 배아 또는 조직에서 대부분 RNAs의 검출에 대 한 매우 민감한, 재현 하 고 경제적인 방법을 제공 한다. 전통적으로 프로브 탐지의 알칼리 성 인산 가수분해 효소 방법의 사용 하는 더 많은 것 보다 약간 더 복잡 하지만 물고기에 의해 얻은 해상도 훨씬 더 큰 하 고 감도 비교 또는 향상 7,8. 전체 또는 일부 결정 플레이트를 사용 하 여 관심사의 유전자의 대규모 또는 제한 된 분석에 대 한 프로토콜을 사용할 수 있습니다. 프로브 생성 모두를 검색할 수 있습니다 또는 프로브는 좀 더 구체적으로 설계 된 하지 않는 한 여러 성적 결합 형성에 주목 해야 한다 (즉, 단일 exons). 우리는 작은 적당 한 성공 가진 200 뉴클레오티드 프로브 테스트, 비록 작은 프로브 덜 효과적일 하는 경향이 하 고 덜 특정 수 있습니다. 명확 하 게,이 프로토콜 microRNAs 처리 또는 작은 introns, exons의 검출에 적합 하지 않습니다.
이 이렇게 효소 단계를 사용 하 여 신호 강도 향상, 하지만 신호 강도 비례 식 레벨의 비교적 선형이 고 광범위 한 범위에서 대상 유전자 발현 하 것 처럼 보인다. 더 높은 확대, 신호 puncta 또는 얼룩으로 볼은 세포와 조직 내에서. 비교적 드문 성적 증명서에 대 한 몇 가지 작은 puncta 볼 수 있습니다. 사본 풍부 하 게 증가 함에 따라이 수와 크기에서 성장 한다. 단일 분자 물고기 (smFISH), 것과 같이 단일 작은 puncta 단일 RNAs에 해당 또한 수 고 한다 또한 쉽게 측정할 수 이미징 및 정보학 소프트웨어를 사용 하 여. 동일한 대상에 대 한 우리 큐레이터 이미지와 함께 smFISH를 사용 하 여 얻은 게시 된 이미지의 비교 제안이 더 엄격한 비교 하 여 테스트 해야 하지만 전반적으로, 감도 및 해상도 두 가지 방법의 상대적으로 비슷한는. SmFISH의 훨씬 더 높은 비용을 감안할 때, 여기에 제공 된 메서드는 비용의 일부분에서 비슷한 결과 주어 야 한다. 그러나, 목표는 작은 성적표 또는 성적 증명서의 부분을 검출 하는, smFISH 것이 좋습니다.
일부 물고기 프로브 작은 크기 때문에이 메서드는 대형 또는 중요 한 장벽을 관통 조직에서 더 나은 수도 있습니다. 그러나, 높은 세제 수준 및 조직 고정 및 permeabilization 조작의 사용이이 문제를 해결 하려면 나타납니다. 마지막으로, 초파리 조직 개발, 해 부 조직에 대 한 여기에 설명 된 높은 세제 버퍼 초파리 배아로 대부분 다른 유기 체와 조직에 대 한 또한 작동 해야 한다.
The authors have nothing to disclose.
이 프로젝트에 대 한 지원 자금 건강 연구의 캐나다 학회 (청소 133473 부여)에 의해 HMK에 교부 금에 의해 제공 했다.
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |