Описанные РНК в situ гибридизация протокол позволяет обнаружение РНК в целом дрозофилы эмбрионов или расчлененных тканей. С помощью микротитровальных 96-луночных пластины и усиления сигнала tyramide, стенограммы могут быть обнаружены на высокое разрешение, чувствительность и пропускную способность и при относительно низких затратах.
В наших усилиях, чтобы определить модели выражения и внутриклеточных локализации РНК в масштабах всего генома дрозофилы и в различных тканях мы разработали многочисленные изменения и улучшения наших оригинальный флуоресцентный на месте протокол гибридизации (рыбы). Чтобы облегчить пропускной способности и эффективности затрат, все этапы, от зонда поколения для обнаружения сигнала, выполняются с использованием экзона 96-луночных микротитровальных пластины. Digoxygenin (DIG)-зонды помечены antisense РНК производится с использованием геномной ДНК или клонов cDNA как шаблоны. После фиксации ткани и permeabilization зонды гибридизированных к стенограммы интерес и затем обнаруженные с помощью правопреемства антитела анти КОПАТЬ конъюгированных к биотин, стрептавидина конъюгированных с пероксидазой хрена (ПХ) и дневно конъюгированных tyramide, который присутствии HRP, производит Высокореактивная средней, которая связывает электронно плотной регионов непосредственно примыкает белков. Эти усилители и локализации шаги производить надежные и очень локализованный сигнал, который облегчает обоих клеточном и субклеточном Стенограмма локализации. Протоколы были оптимизированы для производства очень конкретных сигналов в различных тканях и стадии развития. Ссылки предусмотрены также дополнительные варианты, которые позволяют одновременное обнаружение нескольких протоколов, или стенограммы и белков, в то же время.
Новые методы обнаружения РНК генома общесистемной как РНК seq значительно расширили наши знания, когда и где гены выражены, и на то, что уровни1. Однако они обеспечивают сравнительно бедных временнóго и пространственного разрешения. РНК в гибридизации situ позволяет пространственное распределение стенограммы визуально наблюдается в фиксированных тканей, тем самым раскрывая подробности клеточном и субклеточном локализации2. С помощью флуоресцентной гибридизации in situ (рыба) позволяет даже больше пространственное разрешение, как он позволяет использовать мощный микроскопии методы, такие как конфокальных и легкие лист микроскопии3. Флуоресцентные маркеры например DAPI также может использоваться для установления субцеллюлярные отношения4. РЫБЫ также облегчает наблюдение за несколькими РНК и белков одновременно с четким указанием дублирования на субклеточном уровне. Уникальный реагентов и шаги, необходимые для двойной маркировки можно найти в следующих ссылок на3,5.
Процедуры, описанные здесь используют 96-луночных микротитровальных пластин для всех шагов, включая cDNA шаблон производства (Колония PCR), производство зонд РНК (с использованием стока зависит от полимеразы транскрипции T7, T3 или SP6), в situ гибридизация, и Разработка флуоресцентного сигнала. Достаточное количество эмбрионов или тканей добавляются к каждому хорошо из 96-луночных пластины для оценки последовательности и изменчивости. А затем каждый получает другой зонд. После сигнала развития эмбрионов или тканей от каждой скважины выстроились на отдельных Микроскоп слайды для микроскопического анализа.
Использование tyramide усиления сигнала (TSA) для обнаружения зонд производит надежные сигналы с исключительной субцеллюлярные резолюции 5,6,,78. Субцеллюлярные локализация РНК-это важный механизм регулирования 9 , который появляется происходят практически всех РНК 4,10,11. Эти анализы показали также, что многие стенограмм, которые не определяется РНК seq легко распознаются рыбы 8. Адаптация РНК в situ гибридизация до 96-луночных пластин позволяет анализ до 96 генов интерес одновременно (больше, если дополнительные пластины используются), делая возможным анализ больших наборов данных. Путем разрезания плит на более мелкие разделы, метод также легко адаптируется к всего несколько образцов. Протокол для анализа распределений РНК в большинстве видов тканей. Хотя не показано, он адаптируется к не –дрозофилы тканей также.
Таблица 7: решение гибридизации. 3. дрозофила воспитания и эмбриона, личинок и взрослых ткани коллекции. Примечание: для малых масштабах (бутылки) и масса (коробки) летать воспитания, используют стандартные летать лаборатории протоколы на кукурузной муки на основе продовольствия при 25 ° C. держать надлежащего взрослых и личинок плотности и предоставить дополнительные активные дрожжи порошок на продовольствие поверхностях. Собирать эмбрионов после стандартных протоколов. Основные шаги эмбриона коллекции проиллюстрированы на рис. 3. Примечание: После промывки devitillinized эмбрионов в метаноле, фиксированная эмбрионы могут храниться при температуре-20 ° C на срок до одного года. Permeabilization эмбрионов и после фиксации выполняются на 1 день рыбы протокола. Подготовьте свежие 40% PFA Стоковый раствор. Подготовить свежеприготовленные Стоковый раствор 40% параформальдегида (PFA) путем смешивания 10 мл DEPC лечение ddH 2 O до 3,68 г PFA и 70 мкл 2N Кох в 20 мл во флаконе сцинтилляционные стекла, содержащий небольшой переполох бара Предупреждение: PFA высокотоксичных с потенциальными последствиями острых и хронических здравоохранения. Читать MSDS (листы данным по безопасности материала) и использовать с надлежащей защиты для глаз, кожи и дыхательных путей. В Зонта, тепло и перемешать флакона на 3-5 мин на нагревательной пластинки на 200 ° C, пока полностью не растворится PFA. Удалить PFA Стоковый раствор от жары, как только растворяется PFA (не перегреваться). Прохладно растворенного PFA Стоковый раствор 40% на льду на 5 мин и фильтр с 0,2 мкм фильтром и 10 мл шприц. Третий Инстар личинки (L3) или взрослого ткани фиксации, закалки и permeabilization Примечание: этот протокол должна быть завершена в течение одного дня. Она включает в себя ткани рассечение, фиксации, закалки эндогенного HRP, permeabilization и после фиксации. Подготовить крепежные решения (Fix-I и исправить-II) согласно таблице 8. Примечание: Пикриновая кислота используется в качестве дополнительного фиксатором когда ткань имеет нежный структура, которая должна быть сохранена. Это не хороший фиксатором, когда Ультраструктура ткани должны быть сохранены для электронной микроскопии (EM). Предупреждение: Пикриновая кислота является неустойчивым и имеет способность реагировать с другими материалами и создавать взрывоопасные соединений. Использовать и хранить согласно руководящим принципам безопасности. Личинки место или взрослых мух в пластиковый Тюбик 50 мл, содержащие 10 мл холодного 1 X PBS и 100 мкл Fix-я решение. Холод на льду за 2 мин до уменьшения личинок и взрослых летать моторики. Разрез от оконечности 1 мл пластикового наконечника для создания открытие 2-3 мм. Передачи 10-30 личинки или взрослого летит с наконечником 1 мл в чашке Петри (диаметр 9 см) с мелкой слоем ПБС от 50 мл трубки (шаг 3.3.2). Добавить немного PBTT может снизить поверхностное натяжение. Тщательно анализировать личинок (открыт от передней и сжать ткани от задней к передней) или взрослых тканях интерес с парой острые щипцы под областью рассечения. Примечание: Около 200-300 личинки или взрослый яички могут быть расчленены и исправлена в один день опытными лицами. Передачи расчлененный тканей с 200 мкл пипетки (с наконечником, отрезать для создания открытия диаметром 2 мм) в 1,5 мл трубки и магазин на льду. Заполните каждый раунд рассечение в течение 10-15 мин до прогрессирует к следующему шагу. Примечание: Продолжить дополнительные раунды (в течение 2 ч время окна), насколько это необходимо для создания достаточного материала. Исправление тканей с 800 мкл Fix-я решение для 30 мин на скамейке Топ смесителя. Ограничить полоскания тканей с 800 мкл 1 X PBTT и держать трубы на льду для максимум 2,5 ч. из-за 30 мин., это должно выполняться экстракторах пока не собрано достаточно ткани. Бассейн все расчлененных и фиксированных тканей в одной 15 мл пластиковая трубка, содержащая сетки в крышке (смотрите Рисунок 4 дизайн трубки). Аспирационная лишнюю жидкость через сетку в крышку трубки. Вымойте 3 X 5 мин каждый с 10 мл 1 X PBTT. Дважды промыть 10 мл 1 X PBS для удаления моющего средства. Это предотвращает избыточное пузыри на следующем шаге. Примечание: Если расчлененных тканей опускаться на дно трубки, шаги могут выполняться регулярные микротитровальных пластин или 0,5-1,5 мл microcentrifuge трубы (300-800 мкл объем в трубку). Утолить эндогенного активность ПХ с 5 мл 0,3% H 2 O 2 в PBS для 15 мин на RT. повторить еще раз. Не закрывайте крышку во время этого шага без перемешивания. Полоскать дважды с использованием 10 мл 1 X PBTT. Мыть дважды за 5 минут с 10 мл 1 X PBTT. Разрушения тканей с 10 мл ацетона 80% (-20 ° C, предварительно охлажденный) при-20 ° C на 10 мин инвертировать трубки дважды во время инкубационного периода. Мыть дважды за 10 мин с 10 мл 1 X PBTT увлажняет тканях. Полоскание с 10 мл смеси гибридизации PBTT плюс 5 мл 5 мл раствора (1:1). отменить микс и заменить с 10 мл раствора гибридизации. Образцы можно хранить при-20 ° C до тех пор, пока требуется. Для достижения наилучших результатов, не следует хранить образцы для более чем на неделю. компонент исправить я (10 мл) исправить II (10 мл) 40% акций PFA 1 мл 1 мл PBTT 8.99 мл 9 мл раствора пикриновой кислоты 10 мкл –
Таблица 8: Исправление решения для тканей. 4. гибридизации in situ Примечание: Эта часть протокола требует минимум 2 дня, с образец подготовки, предварительно гибридизации и гибридизации принимая место на день 1 и датчик обнаружения 2-й день. Если количество выборок является относительно высоким, если не знакомы с протоколом, или полный рабочий день не возможен, протокол должны выполняться в течение 3 дней с действия датчика обнаружения и сигнала Усилители, разделен на 2 дня. Большое количество эмбрионов или образцы Иссеченную ткань может также потребовать дополнительных дней для обработки. Для образцов Иссеченную ткань замените 1 X PBT 1 X PBTT во всех шагах, если не указано иное. Дополнительных моющих средств требуется для проникновения многих личинок и взрослых тканей, таких как мозг и яички. Хотя не проверял, 1 X PBTT может также использоваться для эмбрионов. Используйте 100 мкл на хорошо для 96-луночных пластин и 800 мкл для 1.5 мл пробирок. Предварительно гибридизации и гибридизации Примечание: шаги 4.1.1-4.1.6.2 предназначены для эмбриона в situ гибридизация. Для личинок и взрослых ткани в месте гибридизациях пропустите эти шаги. Удалить 2 мл фиксированной эмбрионов (хранится в метаноле при-20 ° C) для новой трубки 15 мл. Вымойте эмбрионов дважды за 7 мин с 10 мл метанола в каждой стирки. WASH эмбрионов за 7 мин с 10 мл смеси метанола и 1 X PBTT (1:1). Вымойте эмбрионов дважды за 7 мин с 10 мл 1 X PBTT увлажняет. Для permeabilization эмбриона, подготовить промежуточный протеиназы K решения (40 мкл/мл) путем разбавления 1: 500 с Стоковый раствор (20 мг/мл). Хранить при -20 ° C. Make рабочего раствора протеиназы K путем разбавления промежуточных протеиназы K решения 1/15 в 1 X PBTT для окончательной рабочей концентрации 2.667 мкг/мл. Permeabilize эмбрионов с 10 мл рабочего раствора протеиназы K (используйте меньшее за меньшее количество эмбрионов). Инкубируйте трубки на RT для 13 мин осторожно перевернуть трубку 4 раза во время инкубации. Инкубировать без перемешивания образцов в растворе протеиназы K на льду за 1 ч. Примечание: Этот относительно длительный инкубационный с разбавленной протеиназы K обеспечивает можно воспроизвести равномерное permeabilization и последующего окрашивания. Хотя эмбрионов разрушения, сделать 2 мг/мл раствора глицина из 10 X запасов (20 мг/мл) в 1 X PBTT для общего объема 30 мл. Решение Удалить протеиназы K, промойте с 10 мл раствора глицина (2 мг/мл) и мыть дважды за 2 мин. Промойте три раза с 10 мл 1 X PBTT для удаления глицин. После фиксации эмбрионов. Подготовить 10 мл 4% PFA (1 мл 40% ПФА в 9 мл PBTT, фильтруют через 0.45 мкм фильтром). Проинкубируйте образцы в 4% PFA для 20 минут Вымойте 3 X 2 мин с PBTT. Для приготовления раствора денатурированного гибридизации, варить гибридизации решение для 5 мин. Для полного 96-луночных плиты используйте три трубки 12 мл. Прохладный на льду сразу на 5 мин Промыть эмбрионов один раз с 10 мл 1 X PBTT: гибридизации раствор (1:1). Промойте дважды с 5 мл раствора гибридизации. Аликвота ~ 20 мкл в колодец поселились эмбрионов (30-40 эмбрионов) или фиксированной тканей в плиту 96-луночных ПЦР на льду. Удаление гибридизации решение из тканей или эмбрионов, с помощью 8-канальный коллектор пипетки ( рис. 1 / видео). Примечание: Коллектор дозатор имеет ‘ остановить ’, что предотвращает советы от собирается в нижней части скважины и удалению образца. Для экспериментов с использованием тканей, которые плавают, удалите жидкость тщательно с 100 мкл пипетки с. Добавить 100 мкл денатурированного гибридизации решения каждой скважины. Предварительно гибридизируйте эмбрионов для минимум 2,5-3 часа на 56 ° C с использованием сухой ванны теплового агрегата, содержащих металлические бусины (см. материалы и рис. 1). Зонд денатурировать 100 мкл приготовленные в 96-луночных ПЦР пластине с помощью Термоциклер 5 мин на 80 ° C. немедленно прохладно на льду на 5 мин. Удаление предварительно гибридизации решения из эмбрионов или тканей. Добавить денатурированного зонды ген специфического для каждого образца, крышка с лентой и гибридизировать в 56 ° C для 16-18 h O/N, под металлические бусины в сухой ванна, Отопление исполнимых 5. Датчик обнаружения предварительно теплой решения в таблице 9 в 56 ° C теплового агрегата. Вынуть пластину зонды. Примечание: Зонды могут быть повторно использованы между 2 – 3 раза при температуре-80 ° C (никогда не магазин, любой РНК образцы в-20 ° C). После гибридизации, двойной мель РНК является более стабильным, чем одиночной стренги РНК и меньше подвержены деградации, вызванной загрязнением РНКазы. Если используется система вакуумной фильтрации мульти хорошо пластины для тканей, коллекции плита должна быть включена в пластину фильтр для сбора зонды (см. видео для сведения Ассамблеи). Гибридизированные ткани нужно будет передаваться от регулярных микротитровальных 96-луночных пластины для гибридизации в один с 1,2 мкм поры размер PVDF мембраны в нижней части каждой скважины. шаг предварительно нагревают раствор (56 ° C) время Объем в хорошо 1 Гибридизации решение: PBTT (3:1) 15 мин 100 мкл 2 Гибридизации решение: PBTT (3:1) 15 мин 100 мкл 3 Гибридизация решение: PBTT (1:1) 15 мин 100 мкл 4 Гибридизации решение: PBTT (1:3) 15 мин 100 мкл 5 PBTT 3 моет 5 мин 100 мкл в таблице 9: мытье зонды после гибридизации. при использовании обычных плиты, мыть образцы согласно таблице 9 в нагревательный элемент в 56 ° C. Если с использованием вакуумного коллектора системы, использовать подогревом решения с вакуумной системой на скамейке и удалять решения непосредственно от ниже, пылесосом. После 3-мыть с 1 X PBTT, нормальной пластины могут быть удалены от нагрева исполнимых Подготовка антител. Подготовить 11 мл раствора первичного антитела (2,5 мкг/мл) со склада (1 мг/мл) путем разбавления конъюгированных биотина мыши моноклональные антитела анти КОПАТЬ (см. список материалов) в PBTTB (1: 400). Если обработка меньшее количество образцов, соответствующим образом скорректировать объемы. Подготовить 11 мл решения стрептавидина ПХ (1 мкг/мл) со склада (1 мг/мл) путем разбавления 1: 1000 стрептавидина ПХ конъюгата (см. список материалов) в PBTTB. Если используется меньшее количество образцов, соответствующим образом скорректировать объемы. Блок эмбрионов или тканей с PBTTB (1% обезжиренное молоко в 1 X PBTT) для 20 мин на скамейке Топ смеситель на RT. Примечание: Фильтр PBTTB с помощью фильтр-бумаги (класс 3, 6 мкм) перед его использованием на 96-луночных фильтр пластины, чтобы избежать засорения фильтров. Вместо PBTB, PBTTB (PBTB с дополнительные 0,3% Тритон X-100) используется для всех тканей во время протокол. Инкубировать эмбрионов или тканей в раствор антител (100 мкл/хорошо) для 2 h на микшер-стендовые образца. Промойте дважды с 1 x PBTTB. Вымойте 3 X 5 мин и 5 X 10 мин с PBTTB. Инкубируйте эмбрионов или тканей с решением стрептавидина ПХ (100 мкл/хорошо) для 1,5 ч, используя миксер-стендовые образца. Мыть 2 X 5 минут с PBTTB. Хранить пробы в темноте с этого момента. Примечание: во всех антитела моет, если ткань теряется из-за непрозрачности, производства молока, попробуйте стирки без молока (PBTT вместо PBTTB). Приготовляют раствор DAPI путем разбавления 100 X DAPI в PBTTB (1: 100). Инкубировать эмбрионов или тканей с DAPI решение (100 мкл/хорошо) для 15 мин на микшер-стендовые образца. Вымойте 4 X 10 мин с PBTT. Хранить 96-луночных пластины с образцами O/N на 4 ° C или перейти к следующему шагу. Примечание: Процедура может быть приостановлена здесь. 6. Обнаружение антител с использованием tyramide (см. Рисунок 5) Примечание: здесь было использовано домашнее цианиновые 3-конъюгированных tyramide, который был подготовлен согласно протоколу, описанных в 12 . Если выполнение многих экспериментов или тестирования многие образцы, это экономит значительное количество денег и эффективной по сравнению с коммерческим реагентов (из опыта). Меньшее количество экспериментов и примеры, коммерчески доступных цианиновые 3-tyramide может использоваться (см. материалы). Плиты, мыть образец 3 X 5 минут с 1 X PBTT. Подготовка tyramide активации буферу (активации) содержащий 0,006% H 2 O 2 в PBTT (разбавить 30% (w/w) H 2 O 2 штока 1: 5000). промойте пластины с буфером активации. Подготовка цианиновые 3-tyramide решение путем разбавления его в буфере активации в 15 мл. Для эмбрионов, используйте 1:80 разрежения (137 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Для личинок тканей используйте разбавления 1: 150 (73 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Для взрослых яичек используйте разбавления 1: 200 (55 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Для взрослых яичников, используйте разбавления 1: 300 (36 мкл цианиновые 3-tyramide в 11 мл активации буфера). Проинкубируйте образцы с цианиновые 3-tyramide решение для 2 h на микшер-стендовые образца. Промойте четыре раза с PBTT. Вымойте 6 X 10 мин с PBTT. Вымойте 3 X 5 мин с PBS для удаления моющего средства. Добавить 150 мкл/хорошо анти исчезают монтажа СМИ. Храните пробы O/N на 4 ° C, чтобы позволить тканей или эмбрионов опускаться до нижней части трубки. Маунт образцы на скольжениях микроскопа (под рассекает область для ткани) и крышка с coverslip. Уплотнение края coverslip с прозрачным лаком. Изображение с помощью флуоресцентным микроскопом. Примечание: анализ отрицательный контроль первым, чтобы получить представление о ‘ неспецифические ’ фон.
Описывается протокол обеспечивает воспроизводимость, чувствительной и экономичный метод для выявления большинства РНК в фиксированных дрозофилы эмбрионов или тканей. Хотя немного более сложным, чем более традиционно используется щелочной фосфатазы метод обнаружения датчика, резолюции, полученные рыбы гораздо больше и чувствительность является сопоставимым или более 7,8. Используя полное или частичное микротитровальных пластины, протоколы может использоваться для крупномасштабных или ограниченный анализ генов интерес. Следует отметить, что созданные зондов может обнаружить все или несколько Стенограмма сращивания формы если зонды более специально (то есть, единый экзонов). Хотя мы проверили зонды, как малые, как 200 нуклеотидов с разумной успеха, меньшие датчики имеют тенденцию быть менее эффективными и могут быть менее конкретным. Очевидно этот протокол не подходит для обнаружения небольших интронов, экзонов, или обрабатываются микроРНК.
Хотя этот подход использует ферментативные шаг, чтобы увеличить силу сигналов, интенсивности сигнала, как представляется, быть пропорциональны целевой экспрессии генов в относительно линейной и широкий спектр выражение уровня. На увеличение, сигнал считается puncta или крапинками внутри клеток и тканей. Для относительно редко стенограммы видны только несколько крошечных puncta. Как Стенограмма залегания увеличивается, они растут в количество и размер. Как с одной молекулы рыбы (smFISH), один небольшой puncta может также соответствуют одной РНК и должен также быть легко количественно с помощью программного обеспечения визуализации и информатики. Сравнение опубликованных изображений, полученных с помощью smFISH с изображениями, которые мы куратор для целей же предположить, что общее, чувствительность и разрешение этих двух методов относительно аналогичных, хотя это должна быть проверена более строгих сравнений. Учитывая гораздо выше за счет smFISH, метод здесь должны дать аналогичные результаты на долю от стоимости. Однако если цель состоит в том, чтобы обнаружить небольшие стенограммы, или отдельных частей стенограммы, рекомендуется smFISH.
Из-за меньшего размера некоторых рыб зондов этот метод также может быть лучше в проникающего тканей, которые являются большими или имеют значительные барьеры. Однако использование более высоких уровней стиральный порошок и фиксации и permeabilization настроек ткани, по-видимому, решили эту проблему. Наконец хотя был разработан для дрозофилы тканей, высокая стиральный порошок буферов, описанные здесь расчлененных тканей также должен работать для дрозофилы эмбрионы, а также большинство других организмов и тканей.
The authors have nothing to disclose.
Финансовую поддержку для этого проекта была оказана Грант HMK канадской институтов здравоохранения исследований (Грант MOP 133473).
15 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB15-500 | Certified DNase and RNase free |
2x PCR Master Mix with dye(Ambiogene) | Biomart (Canada) | 141106-1K | Certified DNase and RNase free |
50 ml Polypropylene conical centrifuge tubes | Frogga Bio | TB50-500 | Certified DNase and RNase free |
96-well filteration plate (1.2 um, hydrophilic PVDF membrane | EMD MILLIPORE | MSBVS1210 | Used to remove liguid from bottom of the plate with floting tissues |
96-well PCR plate (200 μl) | Denville | C18096-10 | |
Acrodisc syringe filter (0.2 u) | PALL | PN4612 | |
Acrodisc syringe filter (0.45 u) | PALL | PN4614 | |
Agarose | Bioshop | AGA002.500 | |
Ampicilin | Sigma-aldrich | A9393-5G | Stock concentration is 100 g/ml disolved ddH₂O and 0.2μm filtered (use as 1/1000) |
AXYGEN 96-well assay storage plates | UltiDent Scientific | 24-P96-450V-C | To store bacterial glycerol stocks |
AXYGEN Aluminum Plate Seals | UltiDent Scientific | 24-PCR-AS-200 | To seal plates |
AXYGEN Wide-bore tips (200 ul) | UltiDent Scientific | 24-T205-WB-C | To transfer samples |
Biotin-SP (long spacer) IgG Fraction Monoclonal Mouse Anti-Digoxin | Jackson ImmunoResearch Lab | 200062156 | Primary antibody for in situ (stock conc. 1 mg/ml, working conc. 2.5 μg/ml or 1/400 dilution. |
BRAND 8-channel manifold (autoclavable) | BrandTech Scientific Inc. | 704526 | To remove liquids from the top of 96-well PCR plates |
Chloramphenicol | Sigma-aldrich | C1919 | Stock concentration 34 mg/ml dissolved and 0.2μm filtered in 100 % EtOH (use as 1/1000) |
Cyanine 3 Tyramide (Cy3-TSA) | Home made | Could be ordered from Perkin-Elmer Cat# SAT704A001EA | |
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) | Sigma-aldrich | D2522 | Antifade reagent in mounting media |
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma-aldrich | D5758 | Working concentration is 0.1 % in ddH₂O. To make RNase free water 0.1 % |
Digoxigenin-11-uridine-5’-triphosphate | Roche | 11-209-256-910 | |
Embryo collection cage | Home made | N/A | Size: 75 cm X 75 cm X 75 cm made with Polymethyl methacrylate |
Eppendorf centrifuge 5804 | Eppendorf | Model 5804 | Centrifuge for 96-well plates on A-Z-DWP rotor |
Formamide | Bioshop | FOR001.500 | |
Glycerol | Bioshop | GLY002.4 | |
Glycine | Bioshop | GLN001.500 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H4784-250MG | Stock: 50 mg/ml. Working concentration 1 mg/ml in Hybridization solution |
Hydrogen peroxide (H₂O₂) | Sigma-Aldrich | 216763-500 ml | |
Lab Armor Beads | DiaMed | LAA42370-001 | Fill in heating unit |
Labnet Gyro M Mini Nutating Mixer | Fisher Scientific | 50-998-347 | Sample mixing |
Mesh – 100 micons | FlyStuff | 57-103 | For collecting embryos |
Mesh – 800 microns | SEFAR – Nytex | 06-780/53 | For catching loose tissue / may be used for special tube in figure 4. |
Micro Cover Glasses | VWR | 48366-067 | Size: 22 X 22 mm |
Micro slides,frstd | VWR | 48312-003 | Size: 25 X 75 mm |
Multi-Well Plate Vacuum Manifold | Pall Corporation | P/N 5017 | Remove liquid from bottom of 96-well filter plate |
Paraformaldehyd (PFA) | Bioshop | PAR070.500 | Fixation |
PCR machine | Bio-Rad | Model: DNA Engine PTC-200 | 96-well plate PCR and probe denature |
Picric acid solution | Sigma-aldrich | 80456 | For tissue fixation I solution |
Potassium Chloride (KCL) | Bioshop | POC308 | |
Potassium phosphate monobasic (KH₂PO₄) | Bioshop | PPM302.1 | |
PP lid for 96-well plates, 100/case | UltiDent Scientific | 24-P-LID-PP | Lid for storing plates |
Progene disposable Reagent Reservoirs (50 ml, sterile) | UltiDent Scientific | 825-1-50-5S | Liquid handling |
Progene Pierceable Aluminum Foil | UltiDent Scientific | 87-CFILM-AL | Seal 96-well plate, DNase and RNase free |
Proteinase K | Sigma-aldrich | P2308- 5MG | Embryo permeabilization |
RiboLock Ribonuclease Inhibitor | Thermo Scientific | EO0381 | 40 Unit/ul |
Ribonucleoside Triphosphate (NTP) set | Roche | 11277057001 | RNA probe sythesis |
RNase free water | GIBCO | 10977015-500ml | RNA probe sythesis |
RNaseZap | Ambion | AM9780 | Remove RNase contamination |
Single stranded DNA from salmon testes | Sigma-aldrich | D9156 | For hybridization solution |
Skim milk (non fat power) | Bioshop | SKI400.500 | Working concentration is 1 % in 1 X PBT or PBTT as a blocking reagent |
Sodium Acetate (NaOAc) 3 M, pH=5.2 (RNase free) | Bioshop | SAA333 | Working concentration is 10 % (v/v) for DNA or RNA precipitation |
Sodium citrate (HOC(COONa)(CH₂COONa)₂ · 2H₂O | Sigma-aldrich | S4641-500G | Reagent in 20 X SSC |
Sodium phosphate dibasic (Na₂HPO₄) | Bioshop | SPD307.1 | Reagent in 10 X PBS |
SP6 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0131 | 20 Unit/ul |
Stainless Steel Shot for Sand Bath | VWR | 13259-274. | To fill the heating unit |
Stereomicroscope & gooseneck light source | Leica | Model: MZ6 | Tissue dissection and mounting |
Streptavidin, horseradish peroxidase (HRP) conjugate | Molecular Probes | S911 | Secondary antibody stock: 1 mg/ml, use 1/1000 dilution (1 μg/ml) for in situ. |
T3 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0101 | 20 Unit/ul |
T7 RNA Polymerase | Thermo Scientific | EP0111 | 20 Unit/ul |
Tip station (10 ul) | Axygen | T-300-STK-S | Certified DNase and RNase free |
Tip station (200 ul) | Sorbio | 27770T | Certified DNase and RNase free |
Tips ( 1ml) | Sorbio | 10200 | Certified DNase and RNase free |
TRITON X-100 | Bioshop | TRX506 | Working concentration is 0.3% in 1 X PBT for tissue in situ |
Tween 20 | Bioshop | TWN510 | Working concentration is 0.1% in 1 X PBT for embryo in situ |
Whatman qualitative filter paper, Grade 3 | Sigma-aldrich | WHA1003917 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions | Preparation | ||
DABCO (1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane) glycerol anti-fade mounting media | DABCO (1.25 g), Glycerol (35 ml or v/v 70 %) and 1 X PBS (15 ml, or v/v 30 %). Keep dark and rock in cold room. store at -20 °C | ||
DEPC (Diethyl pyrocarbonate) treated ddH₂O (1L) | Add 1 ml of DEPC in 999 ml of ddH₂O (0.1 %). Stir O/N in fumehood O/N and then autoclave 45 min liquid cycle | ||
10 X PBS (1L) | NaCL (80 g), KCL (2 g), Na₂HPO₄ (14.4 g), KH₂PO₄ (2.4 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
20 X SSC (1L) | NaCL (175.3 g), Sodium citrate tribasic dihydrate(88.2 g) and unautoclaved DECP ddH₂O (800 ml). Adjust pH to 7.4 with 10 N NaOH and then bring the total volume to 1 L. Autoclave 45 min liquid cycle | ||
1 X PBT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) | ||
1 X PBTT (1L) | 1 X PBS with 1 ml Tween 20 (0.1 %) and 3 ml of Triton-X-100 (0.3 %) | ||
1 X PBTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBT | ||
1 X PBTTB (1L) | 1 % Skim milk in 1 X PBTT |